Американские биологи расшифровали эволюционный механизм, позволяющий бактериофагу лямбда в лабораторных экспериментах вырабатывать новый способ заражения бактериальных клеток. Эволюционное новшество возникает в ответ на приобретение бактериями устойчивости к старому способу вирусной атаки, основанному на прикреплении вирусного белка J к бактериальному поверхностному белку LamB. В этой ситуации отбор сначала закрепляет мутации гена J , усиливающие старую функцию. «Платой» за лучшее связывание с LamB становится дестабилизация белка J. В итоге получаются вирусы, у которых при одном и том же геноме белок J может иметь две разные пространственные конфигурации. При этом вирусные частицы с «правильно» свернутым J заражают жертв старым способом, а другие (с таким же геномом, но с «неправильно» свернутым J) делают это по-новому, прикрепляясь к другому поверхностному белку бактерии (OmpF). В дальнейшем оба варианта могут стабилизироваться путем закрепления дополнительных мутаций, что фактически приводит к разделению исходного вируса на два вида. Работа подтверждает старую, но имеющую мало экспериментальных подтверждений идею о том, что новые функции могут развиваться через промежуточный этап дестабилизации фенотипа с последующей стабилизацией («генетической ассимиляцией») удачных ненаследственных отклонений.
Теоретики давно обсуждают возможную роль дестабилизации фенотипа в появлении эволюционных новшеств. Предполагается, что новшества могут возникать по следующей схеме: «исходный стабильный фенотип → дестабилизирующее воздействие (например, резкое изменение среды) → рост негенетической изменчивости → генетическая ассимиляция удачного фенотипа, то есть закрепление мутаций, стабилизирующих тот вариант фенотипа, который оказался адаптивным в новых условиях ». Об этой модели подробно рассказано в новости Дестабилизация развития - путь к эволюционным новшествам («Элементы», 13.07.2009). Идея выглядит логичной, однако прямых экспериментальных подтверждений у нее пока немного (см. ссылки в конце новости).
Американские биологи, работающие с бактериофагом лямбда (см. Lambda phage), пополнили коллекцию подтвержденных примеров действенности данного механизма еще одним экспонатом.
Изучалось эволюционное новшество, систематически возникающее у фага λ в определенных условиях. В норме этот фаг заражает своих жертв, кишечных палочек Escherichia coli , прикрепляясь к поверхностному белку (рецептору) LamB. Однако жертвы могут выработать устойчивость к вирусу путем накопления мутаций, снижающих уровень экспрессии этого рецептора. Количество молекул LamB на поверхности бактериальных клеток уменьшается, и вирусу становится не за что ухватиться.
В присутствии устойчивых бактерий вирусы подвергаются интенсивному отбору на способность как можно эффективнее цепляться за те немногие молекулы LamB, которые еще остались. Отбор последовательно закрепляет 4–7 мутаций в вирусном гене, кодирующем белок J. Этот белок располагается на конце ножки вируса и отвечает за прикрепление к LamB (рис. 1).
Неожиданным образом эти мутации не только повышают прочность связи с LamB, но и придают белку J новую способность - прикрепляться к другому поверхностному белку бактерии, OmpF. Фактически вирус вырабатывает новый способ заражения бактериальных клеток. Такие вирусы успешно заражают бактерий, даже вовсе лишенных LamB (J. R. Meyer et al., 2012. Repeatability and Contingency in the Evolution of a Key Innovation in Phage Lambda).
Недавно было показано, что получившиеся вирусы-генералисты (способные заражать своих жертв двумя способами) могут затем снова специализироваться, то есть утратить один из двух способов заражения, оптимизировав другой. Это может привести к видообразованию (разделению на два вида). Хотя у фагов λ нет полового размножения, у них есть рекомбинация - обмен участками генома между вирусами, заразившими одну и ту же клетку. С точки зрения эволюционных последствий это почти то же самое, что и половое размножение. Оказалось, что адаптация к хозяевам, у которых есть только один из двух рецепторов (LamB или OmpF), ведет к разделению вирусов-генералистов на две специализированные группы, каждая из которых способна заражать только один тип жертв. Такие вирусы уже не могут меняться друг с другом генами, потому что в их геномах закрепляются несовместимые мутации (J. R. Meyer et al., 2016. Ecological speciation of bacteriophage lambda in allopatry and sympatry). Поэтому их вполне можно считать разными видами.
В ходе нового исследования, результаты которого опубликованы в журнале Science , американские вирусологи разобрались в том, каким образом белку J вирусов-генералистов удается совмещать две функции. У клеточных организмов такие эволюционные изменения обычно происходят за счет дупликации гена с последующим разделением функций между копиями. Но у фагов-генералистов ген J не дуплицирован.
Альтернативный механизм связан с дестабилизацией белка. Авторы предположили, что мутации, закрепившиеся в гене J у фагов-генералистов, внесли элемент хаоса в процесс сворачивания кодируемого белка (см. Фолдинг белка). Возможно, белок J у фагов-генералистов может принимать две разные конформации, одна из которых связывается с LamB, а другая - с OmpF.
Дестабилизация пространственной структуры белка часто сопровождается снижением его устойчивости к повышению температуры. Поэтому проверку своей гипотезы ученые начали с оценки выносливости вирусов к перегреву. Для этого они в течение часа выдерживали вирусные частицы с разными генотипами при разных температурах (от 37°С - оптимальной температуры для фага λ до смертельных 55°С) и смотрели, какой процент вирусов сохранит жизнеспособность. В эксперименте использовались генотипы, соответствующие разным этапам изученного ранее эволюционного пути от исходного вируса (связывающегося только с LamB) к вирусу-генералисту. Изучаемые вирусы различались только мутациями в гене J , а весь остальной геном у них был одинаковый.
Результаты подтвердили ожидания исследователей (рис. 2). Выяснилось, что мутации в гене J , которые в ходе адаптации вирусов к жертвам с пониженной экспрессией LamB повышали сродство J к LamB, а затем дали возможность связываться также и с OmpF, попутно снижали термостабильность белка J.
Впрочем, это само по себе еще ни о чем говорит, потому что мутации, меняющие аминокислотные последовательности белков, часто снижают устойчивость белков к перегреву - это дело обычное. Но в данном случае всё оказалась интереснее. Авторы проверили термочувствительность упомянутых выше вирусов - потомков генералистов, которые в ходе дальнейшей эволюции снова стали специалистами, утратив способность прикрепляться к одному из двух рецепторов. У этих вирусов - «вторичных специалистов» в гене J еще больше мутаций по сравнению с исходным вариантом, чем у генералистов. Однако устойчивость к нагреванию у них оказалась такой же высокой, как и у «диких» вирусов. Таким образом, «генерализующие» мутации снизили термостабильность, а «специализирующие» снова ее повысили.
Самый интересный результат был получен, когда авторы проанализировали временну ю динамику разрушения вирусных частиц при оптимальной для них температуре 37°С. В опыте использовали штаммы с максимальной и минимальной термоустойчивостью, то есть вирусы «дикого типа» и генералистов с семью мутациями (этим двум генотипам соответствуют черная и зеленая сплошные линии на рис. 2). Оказалось, что генералисты со временем разрушаются быстрее, чем «дикие» вирусы. Это ожидаемый результат, потому что от менее термоустойчивых вирусов следует ожидать и меньшей устойчивости при оптимальной температуре. Интереснее другое: исследователи обнаружили, что в течение первых двух суток разрушение вирусов дикого типа идет с постоянной скоростью, тогда как генералисты намного быстрее деградируют в первые сутки, чем во вторые (рис. 3).
Но если все вирусные частицы в выборке одинаковы, то они должны разрушаться с постоянной скоростью. Полученный результат говорит о том, то вирусы-генералисты, по-видимому, представлены двумя разными фенотипами, один из которых неустойчив и разрушается быстро (в основном в течение первого дня), а другой - медленно (примерно с той же скоростью, что и «дикие» вирусы). Однако генотип у всех генералистов один и тот же. Стало быть, речь идет о негенетической изменчивости. Скорее всего, дело тут в разных вариантах сворачивания белка J.
Дальнейшие эксперименты дали ряд косвенных подтверждений этому предположению. Удалось показать, что быстро разрушающаяся фракция вирусов-генералистов преимущественно связывается с OmpF, а медленно разрушающаяся - с LamB. Это видно, например, из того, что по мере разрушения вирусных частиц среди вирусов-генералистов остается все меньше способных связываться с OmpF, в то время как доля связывающихся с LamB растет. А если отобрать те вирусы, которые связались с OmpF, то оставшиеся вирусы, во-первых, лучше связываются с LamB, чем исходная смесь, во-вторых, со временем разрушаются медленнее. Дополнительные эксперименты подтвердили, что изменчивость у вирусов-генералистов действительно негенетическая, то есть ненаследственная.
В итоге вырисовалась следующая схема появления эволюционного новшества. В ходе адаптации к жертвам с пониженной экспрессией рецептора LamB отбор стал поддерживать у вирусов такие мутации в гене J , которые позволяли белку J прочнее связываться с LamB. Это достигалось ценой дестабилизации белка J, который в результате стал иногда сворачиваться неправильно. После приобретения четырех таких мутаций (каждая из которых повышала сродство J к LamB) у белка J появился новый вариант сворачивания, который позволял связываться с другим рецептором - OmpF. Белок с новой функцией возник как один из вариантов фенотипа в рамках негенетической изменчивости. При одном и том же геноме часть вирусов теперь могла связываться с OmpF, в то время как другие обладатели того же генотипа связывались с LamB. Так появились вирусы-генералисты. При этом каждая отдельная вирусная частица намного эффективнее связывалась с одним из двух рецепторов, чем с другим. Генерализация произошла на уровне популяции, а не индивида.
В дальнейшем вирусы-генералисты могут снова специализироваться, попав в подходящие условия (то есть получив доступ к жертвам, у которых есть либо только LamB, либо только OmpF). В ходе специализации закрепляются мутации, повышающие вероятность того, что белок J свернется выгодным в данной ситуации образом. В результате белок J снова стабилизируется, то есть начинает сворачиваться только одним способом. При этом восстанавливается также и устойчивость белка (и всего вируса) к повышенной температуре.
Таким образом, найден яркий пример появления новой функции через промежуточный этап, связанный с дестабилизацией фенотипа. Остается неясным, как часто возникают таким способом эволюционные инновации у вирусов и клеточных организмов. Ответ на этот вопрос должны дать дальнейшие исследования.
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ
РГ8 ОД пРавах ру-
КОТЕРОВ Алексей Николаевич
УДК 577.¡¿13: 547.112
БЕЛКИ ЭУКАРИОТ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ОДНОНИТЕВОЯ ДНК (ББв- БЕЛКИ): ХАРАКТЕРИСТИКА И УЧАСТИЕ В РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК
Москва - 1996
Работа выполнена в Государственном Научном Центре РФ -Ь;-с:итуте биофизики Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности Российской Федерации
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор В.Б. Спиричев,
доктор биологических наук, профессор A.C. Коничев,
доктор биологических наук A.B. Иткес
Ведущее учреждение - Институт биологической и медицинской химии РАМН
Защита диссертации состоится " А^ _" ПСГЛс)Л 1996 г. часов на заседании Диссертационного совета Д.С01.02.Л при Институте питания РАМН по адресу: 10924U, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук
В.М. Жминченко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЬШ"Ы
Актуальность проблемы. Репликация и репарация да обеспечивают пролиферацию клеток, поддержание стабильности генома и устойчивость ДНК к гено-токсическим воздействиям. Эти генетические процессы осуществляются с участием неспаренных нитей ДНК и требуют наличия факторов, способствующих их образованию, стабилизации и зашите от нуклеаз. Компонентами репликатив-ного комплекса бактерий и фагов являются специальные белки, которые путем связывания с однонитевой (он) ДНК, без участия А"ГР, выполняют эту функцию. Эти белки получили названия "белки, дестабилизирующие двойную спираль" ("helix-destabilizing proteins ", ИЛИ "ЦДР"), "расплетающие беЛКИ ("unwinding protein^", ИЛИ "ИР") И "белки, связывающиеся С он ДНК" ("single-stranded DNA-binding proteins ", или "ssb -белки"). Наиболее часто используется последний термин. ssB-белки прокариот не имеют ферментативной активности, обладают субъединичной структурой и кооперативно связываются с он ДНК. Образуя комплексы с ДНК-полимеразами, ssn-белки бактерий и фагов стимулируют ИХ активность / Chase J.W., Williams К.К., 1УЬо/.
Поиск факторов, выполняющих в клетках высших организмов функции ssb-белков, осложняется большими размерами эукариотического генома. Содержание ДНК в клетках млекопитающих превышает бактериальный показатель приблизительно в 3000 раз, причем у эукариот ДНК входит в состав хроматина, содержащего сотни белков. ДНК бактерий реплицируется в одной единице репликации (репли-коне), в то время как для клеток млекопитающих показано наличие десятков и сотен тысяч репликонов /Георгиев P.II., 1989; Збарский И.В., 1988; Faiaschi д., Giacca м., 1994/. Из тимуса теленка были вьщелены ssB-белки (ИР 1 и ИР 2), по ряду свойств аналогичные ssB-балкам прокариот. Хотя они не имели субъеданичной структуры и кооперативного связывания с нуклеиновыми кислотами, эти банки взаимодействовали преимущественно с он ДНК по сравнению с двунитевыми (дн) матрицами и стимулировали ДНК-полимеразы оС /Herrick g., Alberts в.м., 1976/. Позже белки типа ИР получены из ряда других эукарио-тических объектов. По первым открытым полипептццам подобные белки назвали " ssb -белками типа ИР" или "каноническими ssb -селками эукариот". Для них характерна следующая совокупность свойств: 1. Наличие в соматических клетках. 2. Отсутствие ферментативной активности. 3. Высокое содержание (сотни тысяч - миллионы мсшекул/клетку). 4. Относительно высокое сродство к он ДНК "Касс.-^ аиоция с он ДНК-целлюлозы при 0,25-lM №С1). 5. Меньшее
сродство к дн ДНК по сравнению с он ДНК. 6. Способность дэсгаЗотиршгь дн ДНК. 7. Стимуляция активности ДНК-полимераз in vitro ь. Слабая сорбция на
ДЗАЭ-Целлкшозе /Chase O.W., Williams K.R., 1986; Kovalczykowski S.С. et al.« 1981/. Прямых доказательств участия белков типа ИР в метаболизме ДНК получено не бьшо. Однако, ранее использовали не совсем удачные экспериментальные модели и объекты. Так, тимус содержит относительно малое число проли{)е-рируювдх клеток /Мирошниченко И.В. и др., 1987/. ssB-белки в большинстве случаев ввдаляли из клеточной фракции, которая не содержит едерной ДНК (вне-хроматиновая фракция), а не из хроматина /chin y.e. et .al., 1994; Herrick G./Alberts В,1976; Merrill В.M. et al., 1986; Riva S. et al., 1980;1986; Williams k.r. et al., 1985/, хотя для sse-белков постулирована рсяь, основанная на стехиометрическом связывании с он ДНК /Kouaiczykovski s.с. et al., 1981/. Было обнаружено антигенное и структурное родство белков ИР 1 и ЦЦР 1 из тимуса и шеломы шшей с белками гетерогенных ядерных рибонуклеопротеид-ных комплексов (гяРНП-комплексов) и появилось мнение, что низкомолекулярные (22-27 кДз) ssB-белки типа ИР являются продуктами протесшиза белков гяРНП-комллексов. Однако, при этом допускалось существование у ssB-белков и самостоятельной роли В метаболизме ДНК /Chase J.W., Williams K.R., 1986; Jong A.Y.S. et al.,-1987; Merrill в.М. et al., 1986; 1988; Pandolfo M. et al., 1985; 1987; Riva s. et al., 1986/. Известны вадные отличия в свойствах ssb-белков и белков гяРНП-комплексов. Первые преимущественно связываются с он ДНК по сравнению с дн ДНК и РНК, стимулируют ДНК-палишразы<^ и дестабилизируют дн ДНК, а вторые - обладают предпочтением к РНК, не изменяют активности ДНК-псшимераз и, главные балки гяРНП-комплексов, не расплетают дн матрицы. Не ясно такяе, насколько велико преимущественное сродство белков гяРНП-комплексовК ОН ДНК по сравнению С дн ДНК /Burd с. et al., 1994; Kumar айal.,1986; Riva s. et al., 1986/. Помимо низкомопекулярных ssß-белков (ИР 1 и НДР 1) обнаругены и более высокомолекулярные (ИР 2 массой 30-43 кДэ), которые не являются продуктами протесшиза белков гяРНП-частиц /Lahiri d.k., Thomas л.о., 1986/. Для ИР 2 известен аминокислотный состав, показано преимущественное сродство его к он ДНК и способность стимулировать ДНК-палимеразуо< /Merrill В.М. et al ., 1986; Riva S. et al 1980/. Другие СВОЙСТВа ВЫСОКОмолекулярных белков типа ИР высших эукариот исследованы не бьши, и вопрос об их возможных функциях оставался открытым.
Некоторые авторы отрицают необходимость существования у эукариот специ!и-ческих ssB-белков, поскольку их функции предположительно могут выполнять другие группы полипептадов /Richter a. et al., 1986/. Среда последних назывались лактатдегвдрогеназа (ДЦГ) и глицералвдегвд£осфвтдегвдрогеназа (ГАфЦ), которые при низкой ИОННОЙ силе имеют сродство К он ДНК /Grosse F. et al., 1986; Kaiserraan H.B. et al., 1989/, беЛКИ HM6 /Einck L.,Bustin M ., 1985/ И
др. /Richter a. et al., 1986/. Получены многие другие белки, которые in vitro связываются с он ДНК (поэтому иногда их называют "ssB-белками" безотносительно к возможной функции) - продукты протеолиза белка ядрышка нуклеолина /Sapp m. et al., 1985; 1986/, факторы транскрипции /Haas -S. et al., 1995; Negishi y. et al., 1995/, беЛКИ МеЙОЗЭ /Hotta M.< Stern H., 1979/ И Т.Д. /stigare j. et al., 1994/. Оставалось не ясным, какие белки могут осуществлять функцию ssB-белков и необходимы,пи они вообще. Существуют, однако, данные, что инициация репликации ДНК у высших эукариот отличается от подобного процесса у бактерий и даже дрожжей и требует расплетания дн ДНК с образованием бОЛЬШИХ ИНТермеДИатоВ С ОН Структурой /Benbou r.m. et al., 1992/. В клетках млекопитающих обнаружено наличие значительных участков он ДНК, превышающих по размеру фрагменты Оказаки /Lonn и., Lonn s., 1988; Lucchini r.< sogo j.м., 1995/. В ¡слетках до 6% ДНК присутствует в он форме /Збарский И.В., 1988; Панин Л.Е. и др., 1995/. Таким образом, дестабилизация дн ДНК, поддержание он структур в нативном состоянии для функционирования ДНК-псшимераз и защита он ДНК от нуклеаз необходимы, хотя вопрос о том, какие факторы играют роль ssB-белков у эукариот оставался без ответа.
В 1988-1992 г.г. был вьщелен фактор ("репликативный белок А" или "RP-A") который по свойствам был близок к ssB-белкам прокариот. Хотя RP-A млекопитающих некооперативно связывался с он ДНК /Kim с. et al., 1994; 1995/, он обладал способностыо путем образования комплексов с ДНК-репликазой (ДЩ-поли-меразой << с ассоциированной праймазой) и вспомогательными факторами ДНК-полимеразы S стимулировать синтез ДНК in vitro /Када s. et al., 1994/. В 90-х годах RP-A интенсивно изучался и было показано, что у дрожжей этот белок играет роль В генетических процессах /Guzder S.N. et al., 1995; Longhe-se m.p. et al., 1994/. Ряд фактов не позволяют сделать вывод, что в клетках высших эукариот RP-A является единственным ssB-белком. Содержание его в клетке относительно мало (порядка (5-6)"10^ молекул/клетку /кеппу м.к. étal ., 1990; Nasheuer н.p.et al.,1992/ и приблизительно равно как числу реплико-нов /Збарский И.Б., 1988; Falaschi м.в. et al ., 1994/, так и молекул ДНК-пслимеразы et (6-10^ /Hubacher и., 1983/Л с которой RP-A образует комплекс. Поэтому в клетках эукариот должны быть и другие полипептнцы, осуществляющие функции ssB-белков не только при инициации репликации (как RP-A /Adachi y., Laemmii U.K., 1992/), но и на стадии элонгации, когда необходимо поддержание стабильной структуры он ДНК. В опытах in vitro RP-A мог играть последнюю рель /waga s. et ai., 1994/, однако in vivo его количество достаточно: только для образования комплекса с праймазой. Наиболее вероятными кандидатами на con л------ """авались белки типа ИР, хотя до получения специальных дан-
них нельзя было сказать, что и другие группы полипептвдов (ДПР, белки НМ6 и. др.) не играют подобной роли.
В Вэссии и странах бывшего СССР ssB-белки эукариот не исследовались. Можно упомянуть изучение sss-белка фага Т4 (продукт гена 32) /Дебабов И.Г., 1979/ и опыты Г.Е. Зрадкина с соавт. на мутантных штаммах E.coli , лишенных способности синтезировать ssB-белок /Зрадкин Г.Е., 1983/. В то же время," за рубежом поиск специфических ssB-белков эукариот ведется достаточно интенсивно. Но и у зарубежных авторов отсутствуют сведения о ssB-белксх типа ИР насекомых. Показано, однако, что целый ряд факторов репликации и репарации ДНК, созревания мРНК и других процессов у насекомых и млекопитающих аналогичны /Коничев А.С. и др., 1982; Михайлов B.C. и др., 1990; Marton r.e. et al., 1994; Katunis E.L. et al., 1992/.
F&Hee ssB-белки типа ИР вьщеляли преимущественно из слабопролиферирукхцих клеток и тканей, а их исследование ограничивалось молекулярно-биологическими и биохимическими опшаи in vitro . Отсутствуют данные о динамических изменениях количества ssB-балков в популяциях делящихся клеток. Нет сведений о том, с кш^&и нуклеиновыми кислотами связаны ssB-белки in vivo, и связаны ли вообще (поскольку вьщеление проводили из внехроматиновой фракции). Поэтому, нами в качестве основного объекта исследования бьши выбраны проли£ерирующие клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ; перевиваемая опухоль мышей, развивающаяся в брюшной полости). На соврешнном этапе изучения факторов, участвующих в генетических процессах у эукариот, выбор АКЭ представляется целесообразным. Действительно, в 90-х годах основными объектами исследования подобных факторов служит Неьа /кеппу м.к. et al., 1990; waga s. et al., 1994/, представляющая исходно клетки рака матки. Главный подход при изучении факторов репли-каирл и репарации ДНК заклшается в вьщелении из раковых клеток (Het-a) белков, которые стимулируют репликацию ДНК вируса sv40 in vitnywaga s. et al., 1994/. Однако, такие m факторы обнаружены и в нормальных тканях /Atrazhev a. et al., 1992; Podust v.n. et al., 1993; 1994/. Известно, что основные закономерности репликации и репарации ДНК в клетках опухолей и нормальных тканей во многом аналогичны /Збарский И.Б., 1988/.
Другим объектом исследования является грена (яйца) тутового шелкопряда. Это насекомое имеет столь высокую хозяйственную значимость, что ему иногда придают статус "лабораторного объекта" /Клименко В.В., 1975; йшппович Ю.Б., 1963/. Поэтому, изучение факторов репликации ДНК в клетках грены приобретает большую важность.
В связи с изложенным, становится ясным, что исследование факторов, выполняющих в клетках высших эукариот функции ssB-белков яшшется весьма актуаль-
ним, а выбор нами в качестве основных объектов таких популяции прсшиферирую-щих клеток, как АКЭ и грена тутового шелкопряда, представляется оправданным.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в получении, путем постановки экспериментов и углубленного сравнительного анализа литературных данных, доказательств участия sse-белков в репликации и репарации ДНК у эукариот.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Выделить ssB-белки из клеток млекопитающих (АНЬ) и насекомых (грена тутового шелкопряда) и охарактеризовать их свойства. Разработать метод количественного определения ssB-белков в клетках эукариот.
2. В опытах на молекулярном уровне (с очищенными ДНК-полимеразами и ДНК-репликазой) изучить способность ssb -белков изменять активность ферментов репликации и репарации ДНК.
3. В экспериментах на субклеточном уровне (клетки и ядра, проницаемые для макромолекул) исследовать стимуляцию ssB-балками репликативного синтеза ДНК.
4. Провести сравнительное изучение основных свойств ssB-белков, полученных из двух клеточных фракций, одна из которых содержит ядерную ДНК.
5. Определить типы нуклеиновых кислот, с которыми ssü-белки связаны в клетках in vivo.
6. На клеточном уровне исследовать связь мевду содержанием ssb -белков
и интенсивностью репликации ДИК в популяциях клеток, характеризующихся различным пролиферативным статусом (рост АКЭ и развитие грены); при подавлении и стимуляции репликативного синтеза ДНК.
7. Выяснить, участвуют ли ssB-белки млекопитающих в репарации ДНК после облучения УФ и у-радиацией. ,
8. Исследовать специфичность ssB-белков типа ИР как отдельной группы, отличной от других белков эукариот, связывающихся с однонитевымн нуклеиновыми кислотами.
У. Определить специфичность ssB-оелкоБ для различных классов эукариот на примере млекопитающих (АКЭ) и насекомых йрена тутового шелкопряда).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. ssB-белки типа ИР представляют собой спещ-фмную ipynny негистоновых белков хроматина, отличную от других ДНК-связываюших белков и ферментов. ssB-белки спецдачны для клеток млекопитающих и насекомых.
"¿. ssb-белки типа ИР принимают участие в репликации ДНК в клетках эукариот.
3. ssb-белки типа ИР участвуют в репарации ДНК в клетках млекопитающих.
Научная новизна работы. В рамках непосредственно ответа на основные вопросы диссертации:
1. Впервые установлено, что ssB-белки типа ИР представляют собой группу, по совокупности свойств отличающуюся от других групп белков, связывающихся с однонитевыми нуклеиновыми кислотами.
2. Впервые вьщелены и охарактеризованы ssB-белки типа ИР из клеток насекомых.
3. Впервые продемонстрирована способность ssB-белков из АКЭ и грены тутового шелкопряда дестабилизировать дн ДНК.
4. Обнаружено разнонаправленное действие ssB-белков из АКЭ на активность ферментов репликации и репарации ДНК (ДНК-пслимераз Ы. и J)). Впервые показан ингибирующий эффект ssB-белков типа ИР на активность ДНК-репликазы и праймазы. Впервые получены данные об активирующем действии ssB-белков типа.iP на некоторые ДНК-полимеразы прокариот.
5. Впервые обнаружен активирующий эффект ssE-балков на репликацию ДНК в опытах нэ субклеточном уровне (клетки и ядра, проницаемые для макромолекул).
6. Впервые показана специииность ssB-белков для клеток млекопитающих и насекомых.
7. Впервые проведено сравнительное исследование ssB-белков, выделенных из разных клеточных фракций, сдна из которых содержит, а другая не содержит, ядерную ДНК.
В. Впервые установлено, что фосфорилирование ssb-белков типа ИР повышает прочность связывания их с он ДНК.
У. Впервые показано, что в хроматине ssB-белки связаны с ДНК, а во вне-хроматиновой фракции могут контактировать с гяРНК.
10. Впервые обнаружено, что содержание ssB-белков в хроматине клеток эукариот строго коррелирует с интенсивностью репликативного синтеза ДНК.
П. Впервые продемонстрировано участие ssB-белков типа ИР в репарации ДНК в клетках млекопитающих после облучения.
Следует отметить, кроме того, что впервые проведен углубленный анализ литературных данных, позволивший получить дополнительные сведения о возможном участии как ssb -белков, так и других групп ДНК-связываюшцх белков, в репликации ДНК. Некоторые впервые полученные-данные имели вспомогательный характер. Так, впервые дая белков из плазмы крови шекопитакхцих, связывающихся с он ДНК, показана способность стимулировать ДНК-полимеразу оС и ингибировать экзонук-леазу in vitro . Впервые обнаружено, что количество этих белков повышается при лучевой патологии. В специальных опытах впервые продемонстрировано, что
очищенный цинк-металлотионеин (цинк-ИГ) стимулирует репликативный синтез ДНК и повышает уровень белковых факторов репликами (в данном случае, ббв-белков) в клетках костного мозга млекопитающих. Впервые показано, что хроматография на вт-целлюлозе может служить методом оценки ДНК-расплетакхцей активности белков.
Практическая значимость. Доказательство роли конкретных белковых факторов в репликации и репарации ДНК у высших организмов является актуальным для понимания механизмов этих процессов, которые обеспечивают, с одной стороны, пролиферацию клеток, а, с другой, поддержание стабильности генома и его устойчивость к генотоксическим воздействиям. Отсвда следует важная практическая значимость подобных исследований для различных областей биологии и медицины. Понимание процессов регуляции репликации и репарации ДНК опухолевых клеток может оказаться важным для разработки рациональных основ лечения злокачественных новообразований. Определение уровня ББВ-белков может послужить маркером пролиферативной активности как нормальных клеток, так и клеток опухолей. Исследование механизмов репликации ДНК и пролиферации клеток грены весьма ценно в связи с высокой хозяйственной значимостью шелкопряда. Содержание белков плазмы крови, связывающихся с он ДНК, может послужить основой для разработки метода биоиндикации радиационного поражения организма и роста олухолей.
Разработанные в диссертации методы могут быть внедрены как в области фундаментальной биохимии и молекулярной биологии (способ оценки ДНК-распле-тающей активности белков), так и в клинике (метод определения количества Бгв-белков в тканевых экстрактах и применение фильтров с фиксированной ДНК).
При выполнении диссертации в Институте биофизики Р5 (ГНЦ РФ- ИБФ) получены три удостоверения на рационализаторские предложения:
1. "Способ измерения ДНК-связыващей активности ДНК-расплетающего белка из клеток эукариот" (Уд. «5 1185 от 28.09.87 г.).
2. "Применение бумажных фильтров с фиксированной ДНК в качестве носителя при хроматографии белков, связывающих ДНК" (Уд. № 1220 от 9.02.88 г.).
3. "Метод оценки ДНК-расплетакхцей способности белка, связывающегося с однонитевой ДНК (Бзв-белка)" (Уд. № 1293 от 23.05.90 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 9-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), Всесоюзном совещании "Гомеостаз при радиационном повреждении организма" (Пущи-но, 1987), Мевдународном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизма функционирования генома" (Тбилиси, 1987), 1-м Всесоюзном радиобиоло-
гическом съезде (Москва, 1989), на научных конференциях молодых ученых Института биофизики МЗМП Р£ (1986, 198?, 1988, 1989), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990), на Всесоюзной конференции "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды" (Ленинград, 1991), на 2-м Радиобиологическом съезде (Киев, 1993), на конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы" (Москва, 1995).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы (563 источника). Работа изложена на 498 страницах, содержит 77 рисунков и 22 таблицы.
МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ
Животные. Использовали: беспородных мышей (22-28 г), мышей (cbaxc57bi)f1 массой 22-32 г, беспородных крыс (300-400т), кроликов "Шиншилла" (около 2 кг), поросят (около 50 кг; содержались в виварии Института биологической физики РАН, Пущино) и одну собаку-самца (12 кг).
Основные объекта исследования. АКЭ (гиперципловдный штамм) пассировали на мышах. Прена тутового шелкопряда Bombyx mori l (гибрвд "Кавказ 1 х Кавказ 2") предоставлена Е.П. Андриановой. Развитие зародыша (при комнатной температуре) ивдуцировали путем помещения диапаузирующей грены в горячую воду.
Жизнеспособность АКЭ определяли по пролиферативной активности, подсчиты-
вая число клеток в опухоли на 6 день ее развития после введения мышам 4*10 клеток АКЭ /Проскуряков С.Я. и др., 1986/.
in vitro клетки АКЭ культивировали в среде 199 (5-10 клеток/мл) с 20%-й инактивированной сывороткой крупного рогатого скота, 0,9 мг/мл глутамина, 5 мг/мл глюкозы, 1,5 ыг/мл NaHCo3> 2 тыс. ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 20 мкл/мл асцитной жидкости при 37° в 5%-й атмосфере C0g. Клетки полностью сохраняли жизнеспособность и целостность (определяли по исключению эозина) в течение 30 ч, хотя деления клеток не обнаружено. Содержание общего белка во внехроматиновой фракции и хроматине оставалось неизменным.
Облучение АКЭ УФ (лампа БУВ-1, длина волны 254 нм) для индукции репара-тивного синтеза ДНК проводили в растворе Хенкса (5-10 клеток/мл) при мощностях дозы 0,51 и 1,43 Дд/м2.
Воздействие -излучением. АКЭ (1-Ю8 клеток/мл; 0.15М Nací) и мышей обл-1
учали лучами Сз на установке ИГУР (1,74 Гр/ыин). Поросят облучали Со
в Институте биологической физики РАН (выполнено II.И. Сорокиной).
ДНК из АКЭ и молок лососевых рыб выделяли по Мармуру /Химия и биохимия нуклеиновых кислот, Д.: 1968/. Для получения /3Н/-Д11К, мшгам с АКЭ трехкрат-
но вводили / Н/-тимвдин (по 100 мкКю/мышь в день) и затем -вьщоляли ДНК, удельная радиоактивность которой составила 1000 имл/мин на 1 мкг.
Ядерную FHK из АКЭ получали по /Транскрипция и трансляция, В.: 1987/..
Гянш-частици ИЗ АКЭ вьщеляли ПО /Kish V.M., Pedersen т., 1975/.
Содеряание дн ДИК и ДНК с он участками в препаратах очищенных ДНК и в клетках АКЭ определяли хроматографией на bnd-целлюлозе /scudiero d. et ai., 1975/. На этом же методе был основан разработанный нами способ определения ДНК-расплетащей активности ББв-белков.
Репликативний синтез ДК в интактных клетках АКЭ и костного мозга регистрировали по включению / HZ-тимццина /Seki s., Oda т., 1978/. В гроницаеид для макромолекул клетках АКЭ и ядрах грены (получали путем обработки 0,05%-м
тритоном Х-100) - по модафщированному методу /Borger n-л. et al., 1976/, ос-
нованному на включении / Н/-ТМР после инкубации препаратов с / Н/-ТТР, dATP,
dCTP и dGTP в присутствии AIP. Синтез имел репликатнвную природу - отмечено слабое влияние на его интенсивность ингибитора ДНК-полимеразиуЯ (ddiTP) и подавление ингибитором ДНК-полимеразы vi (N-этилмалеимццом). Репликативный синтез в проницаемых клетках и ядрах линейно зависел от количества клеток АКЭ пли общего белка ядер грены в пробе, а также от времени инкубации. Как и ранее /Berger N.A. et al., 1976/, отмечено ингибирование репликативного включения в проницаемые клетки препаратом гистона, что подтвервдает корректность использованного метода.
Репаративный синтез ДНК в интактных клетках АКЭ после облучения определя-3 -2
ли по включению / Н/-тимщина на фоне 10 М оксимочевины (ОМ) при инкубации
■ в течение 30 мин /ни j.j. et al ., 1995/. Поскольку ОМ подавляла репликацию не полностыо (на 90-95%), для рагчета истинно? пелнчшы репаративного синтеза ("корректированный репаративный синтез") вводилась поправка на ингибирование облучением остаточного репликативного включения на фоне ОМ. Правомочность поправки показана с помощью разделения метки, включенной в "утяжелен- 1 ную" 5-броздезоксиурццином ДНК,на репликативный и репаративный пулы путем центрифугирования в градиенте плотности csci/Lee j.c. et al., 1974/.
В проницаемых клетках АКЭ репаративный синтез ДНК регистрировали по /seki s., Oda т., 1978/. Метод был основан на том, что при удалении из среды инкубации проницаемых клеток с / H/-TIP АТР, регистрируемое включение метки обусловлено репарацией ДНК /seki s., Oda т., 1978/.
Ецделение ssB-белкоБ из АКЭ проводили в препаративном (из 18-52 г кле-
ток), полупрепаративном (2-5 г клеток) и аналитическом (1-3)*10 клеток) вариантах,- которые были аналогичны, но различались объемами использованных растворов и носителей. Все буферы содержали 1 мМ фенилметансульфонилфгорид, 10 Ш бисульфит и 12 мМ 2-меркаптоэтанол (МЭ).
Клетки суспендировали в 2,5 объемах (в аналитическом варианте г в 1 мл) 2 мМ фосфатного буфера, рН 8, 5 t.M ЗДГА, добавляли 1/2 объема 0,75%-го тритона Х-100 - 5 мМ ЭДГА, рН 8, осторожно гомогенизировали и центрийтировали (15 мин, 7 тыс.д). Надосадочные белки ("внехроматиновая фракция") хранили отдельно. Осадок хроматина промывали буфером "Г (20 мМ трис-НС1, 1 ьМ ЭДГА, рН 7,8) и экстрагировали 2,5 объемами 2М Nacln 15%-го псшиэтиленгликоля в этом не буфере. Экстракты (внехроматиновый и хроматина)либо объединяли, либо очищали далее раздельно. Ионную силу доводили до 50 мМ по Nací путем диализа (18-20 ч; препаративный вариант), или путем разведения экстракта хроматина и добавления во внехроматиновую фракцию соли до нужной концентрации (аналитический, полупрепаративный и часть выделений в препаративном варианте). Наносили на колонки с дн ДНК-целлюлозой и он ДНК-целлюлозой, соединенные последовательно. Емкость первой колонки была достаточна для сорбции 100% белков, связывающихся с дн ДНК-целлкшозой. Промывали 50 мМиасгв буфере Т, затем разъединяли и он ДНК-целлюлозу промывали двумя объемами 0,1М NaciB буфере Т. ^.в-белки элюировали двумя объемами 0,6М NaciB буфере Т. Злюаты доводили до 0,1М Nací диализом, ультрафильтровали (полупрепаративный и препаративный варианты) и пропускали через колонку с ДЭАЭ-целлкшозой. ssB-белки злюировались со свободным объемом. В аналитическом варианте алюаты с он ДНК-целлкшозы разводили суспензией ДЭАЭ-целлюлозы в буфере Т до ОДМ Nac;.центрифугировали и собирали надосадочную жидкость. Далее препараты подвергали термоочистке (60°, 15 мин с последующим удалением выпавших в осадок белков центрифугированием в течение 30 мин при 18 тыс.д).
Евдеяение ssb -белков из хроматина грены проводили аналогично. Ядра грены, полученные по /Куранова О.П. и др., 1985/, суспендировали в буфере Т и солю-билизироБали, добавляя 1/2 объема 0,75%-го тритона Х-100 - 5 мМ ЭДГА, рН 8. Далее выделяли ssB-белки как описано выше.
Выделение белков, связываюсдахся с он ДНК (БСД) из плазш крови млекопитающих осуществляли также, как и ssB-белков, нанося на ДНК-целлкшозы вместо экстрактов плазму крови в буфере Т, содержащем 50 мМ Nací.
ЕЬщеление ДНК-шлимераз
(получение описано выше) наносили на дн дак-целлюлозу и алюировали вогнутым градиентом концентрации Naci(80 »AI - 1,5М; концентрацию соли здесь и далее определяли кондуктометрически) в буфере Т. йракции с ДНК-полимеразной активностью наносили на ДЭАЭ-целлюлозу при 0,15М касьДНК-полимеразу^ ашои-ровали со свободным объемом, а ДНК-полимеразу - линейным градиентом концентрации Nací в буфере Т (70 ьМ - 1М; алщия при 0,23-0,33 и 0,39-0,45м"соли). Далее проводили параллельную очистку ферментов на-он ДНК-цашшозе (алкция полимеразы o¿ при 0,1-0,35М, a ß - при 0,1-0,4M №С1) и фосфоцел-люлозе (алюция при 0,3-0,5 и 0,6-0,8М №с1). Очистку ДНК-палимеразыß заканчивали, а ДНК-лслимеразу оС из ЛКЭ без праймазы /Yagura т. et ai., 1982; 1986/ и ДНК-репликазу разделяли на Сефадексе G - 200.
Ошстка цинк-ИГ. Использовали компиляцию описанных методик /Heilmaier н., summer к.н., 1985;Kagi j.H.R. et al ., 1974/ с модификациями. Доя индукции синтеза (Я крысам вводили znci2 (10 мг zn на 1 кг), через 1 сут изалекали печень, гомогенизировали в 10 мМ трис-HCl, pH 7,4, центрифугировали и надоса-дочную жадность подвергали термоочистке (2 мин при 80°с последующим центрифугированием)." Экстракт после концентрирования наносили на колонку с Сефа-
дексом 6 - 75 и алюировали тем же буфером. Пик цинк-МГ определяли по свя-109
зыванию ivJCd кадмий-гемоглобиновым методом /Eaton D.L., Toal В.F., 1982/. Цинк-МТ был гомогенным по данным электрофореза с Ds-Na ; его молекулярная масса (7,2 кДа) и спектр поглощения в УФ совпадали с описанными ранее /Kagi J.H.R. et al., 1961; 1974/.
Определение активности ферментов.
ДНК-пслкиераза. Инкубационная смесь (0,1 мл) содержала 60 мМ трис-HCl, pH 7,8, 10 ¡Al МЭ, 7 мМ Mgci2,0,2 мг/мл БСА, по 20 мк.М dATP, dcrp, dGTP, /3Н/-TIP (300-400 имп/мин на 1 пкмоль), 3-6 мкг ДНК (АКЭ или молок), денатурированной нагреванием или активированной ДНКазой 1 и 5-10 ед ДНК-пслимераэ. Инкубировали 30 мин при 37° и регистрировали радиоактивность в кислотонераст-воримой фракции. При определении активности,".нк-полимеразыу? проба содержала 0,1М KCl.
ДНК-релликаза. По методу /Grosse f., Krauss G.j., 1985/, основанному на регистрации прироста активности ДНК-полимеразы o¿ в присутствии гетр (суб- 1 стратов праймазы).
Прайма. По /Yagura т. et ai., 1986/ (включение / Р/-АМР).
Экэонуклеаза. 1. Путем инкубации белков с / Н/-ДНК из АКЭ с последующим определением количества гвдролизованной ДНК по радиоактивности в кислоторас-творимой фракции. 2. По /Крутяков В.М. и др., 1983/ осуществляла Н.Е. Клейщэ.
Эвдонуклеаза. Активность оценивали по числу он разрывов, образующихся в молекуле ДНК фага Я при инкубации с ней исследуемых белков (седиментация ДНК в градиенте щелочной сахарозу). Эти опыты выполнены В.А. Троновым.
ДНК-зависимая АТРаза (геликаза). По методу /Cobianchi f. et ai., 1982/.
ДЦГ. Активность в растворе определяли по /Кочетов Г.А., 1971/, а на зи-мограмйе - по /Гааль Э. и др., 1982/.
Определение связывания белков с да и он нуклеинов»« кислотами проводили четырьмя способами: 1. Регистрируя количество меченой ДНК, связываемой белками на нитроцеллюлозных фильтрах /otto в. et al., 1977/. 2. Конкурентным" вытеснением связанной с белками меченой он ДНК избытком исследуемых немеченых нуклеиновых кислот (регистрация по способу 1). 3. Сорбцией на он ДНК-целлюлозе в пробирке при 50 Ш Nací 4. Хроматографией ssb-белков на микроколонке с он ДНК-целлюлозой.
Условия определения контакта ssb -белков АКЭ с нуклеиновыми кислоташ in
vivo. fíjK. ДНК АКЭ промечивали, вводя мышам с опухолью / Н/-тимидин (по 130 мкКю/мьгшь на 6 и 7 день роста АКЭ). Извлекали АКЭ и облучали клетки in"vitro в 0,15М tea УФ (3000 Дж/м^) для индукции сшивок белки-нуклеиновые кислоты /Boulikas т., 1986; strniste G.F., Rail s.c., 1976/. Получали внехроматино-вую фракцию и хроматин, который обрабатывали ДНКазой 1 (50 мкг фермента на 1 мг ДНК) в течение 30 мин. Далее экстрагировали хроматин 2М tiaci - 15%-м полиэтиленгликсшем и проводили ввделение ssB-белков из внехроматиновой фракции и экстракта хроматина как описано выше. Определяли удельную радиоактивность препаратов ss&-белков.
raFHK. АКЭ инкубировали in vitro с 0,4 мкг/мл актиномщина Д (для подав-
ления синтеза рРНК) и с / Н/-урвдином (20 мкКю/мл) в 0Д5М N=d 20 мин /ste-venin J. et al., 1977; Wagenmakers A.J.M., 1980/. Отмывали КЛеТКИ 0Д5М NaCl, .¿спевдировали в этом же растворе и облучали УФ (4000 Д»/А. Хроматин и внехроматинозую фракцию обрабатывали РНКазой А (25 мкг/ил) и далее проводили ввделение ssB-белков и определение их удельной радиоактивности.
Оценка периода попуаизни sse-белков АКЭ. Белки промечивали, инкубируя
клетки в течение 20 ч с / Н/-лейцином (2 мкКю/мл). Затем суспендировали клетки в среде без метки и инкубировали еще 10 ч. Через различные промежутки времени второй инкубации выделяли ssB-белки и определяли их удельную радиоактивность.
Проиечивание &зв-ч5елков /^Р/-ортофосфатом in vivo проводили, инкубируя клетки АКЭ (в 0,15М Nací, 20 мМ НЕРЕвбуфере, рН 7,4) с 50 мкКю/мл /^р/-0р-тофосфата в течение 2 ч при 37°. Затем проводили ввделение ssB-белков, осаж-
дали ТХУ и.определяли удельную радиоактивность (связанный с ssB-белками / Р/).
/^C/-ssb -белки АКЭ получали путем метилировали аминогрупп очищенных ssa-белков /*4С/-форыалвдегццом по методу /Остерман Л.Л., у. :1983/.
Фоофорилированне ssb -белков АКЭ in vitro сАМР-зависимой протеинкиназой проводили по /Bechtei p.J. et al., 1977/, a Са-фосфолипидзависимой протеинкиназой - по /Воротников A.B. и др., 1988/ (выполнено A.B. Воротниковым).
Получение антасыворотни кролика к ssb -белкам из АКЭ и проведение гамуно-ферыентного анализа. Иммунизацию кроликов проводили семикратно с двухнедельными интервалами /Иммунология. М.: 1983/. Титр антител определяли с помощью иммуноферментного анализа /Александрова И.А. и др., 1987/ который осуществляли автор диссертации (под руководством А.Ю. Сазыкина) и Е.П. Ацприанова.
Аминокислотный состав ssB-белков на приборе " lkb-о/ " по методу /Практическая химия белка, М.: 1989/ проводили Н.В. "Гарасенко и Е.П. Андрианова.
Электрофорез и иицуноблоттинг белков. Электрофорез в трубках ПААГ в присутствии Ds-Na проводили по Лэммли /Гааль Э. и др., 1982/; алектрофорез на пластинках ПААГ И ишуноблоттинг на приборе "Bio-Rad Protein " осуществлял А.Ю. Сазыкин.
Иэоалектрофокуафование проводили на приборе "Multiphor" фирмы "lkb" (Швеция) по методике этой фирмы.
Определение концентрациябелка проводили спектрофотометрически, методом Лоури /Кочетов Г.А., 1971/ и с Кумасси 6 - 250 /Spector т., 1978/; ДНК -спектрофотометрически, методами Бартона и Дише; FHK - спектрофотометрически и орциновым методом /Химия и биохимия нуклеиновых кислот, Л.: 1968/.
Фосфор в препаратах ssb -белков определяли по /нозз н.н., Dorr j.в.,1975/.
Использованные препараты нуклеиновых кислот и белков. ДНК-целлюлозу готовили по /Litman R.M., 1968/, используя ДНК из молок лососевых рыб (11-10® Да, предоставлена В.А. Троновым). /^С/-ДНК из E.coli (10 тыс.имп/мин/мкг) -" AiEtïtem " (Великофитания). ДНК-псшимераза фага Т4 (140 тыс.ед/мг) - НПО "Фермент" (Вильнюс). Д1®-ПСШИМераза Bacillus stearothermophilus (1000 еД/мг) предоставлена Л.А. Носкиным. Фосфодиэстераза змеиного яда - "caibiochem (США). Протеинкиназа С из мозга крыс очищена.»..В, Воротниковым по оригинальному методу. Каталитическая субъединица сАМР-зависимой протеинкиназы из мышц кролика, очищенная по /Bechtei p.J. et al., 1977/ (1257 ед/мг) предоставлена A.B. Никольским и H.B. Пушкаревой.
Статистическую обработку результатов осуществляли по t критерию Стыодента. На рисунках и в таблицах представлены M im. Коэффициенты корреляции рассчитывали на ЭВМ.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ssb -БЕЛКОВ ИЗ АКЭ
Выделение проводили из объединенного кпеточного экстракта и отдельно из внехроматиновой фракции и хроматина. Белки, имеющие свойства канонических ssß-белков (см. ВВЕДО1ИЕ) на 95% элюировались с он ДНК-целлкшозы 0,6М Nací. При дальнейшей алюции 2М солью, пропускания через ДЭАЭ-целлюлозу и термообработке (ssB-белки характеризуются тевмостабилыюстыо /carrara g. et al., 1977; Herrick g., Alberts в., 1976; Richter a. et al., 1978/), в препарате практически не отмечено содержания белка. После очистки ssB-белкон из экстракта хроматина не 2М, а 0.35М Nací (в котором содержатся белки НМ6 /Збар-ский И.Б., 1988/), белка в препарате также практически не зарегистрировано. Таким образом, в ssb-белках АКЭ отсутствуют примеси белков НМб.
Обнаружена прямо пропорциональная зависимость мевду количеством выделенных ssB-белков (из тотального экстракта и отдельно из двух фракций) и исходной массой или количеством клеток АКЭ (г от 0,86 до 0,99). При внесении /■^C/-ssB-6eflKOB в экстракт и выделении в аналитическом варианте, радиоактивность полученного препарата ("recovery") составила 87-90% от исходной. Сделан вывод, что выделение ssb-белков может служить методом их количественного определения в клетках.
Молекулярная масса и pl. При Э5 в ПЛАТ с оз-на ssb-белков из объединенного экстракта и отдельно из двух фракций (см. далее рис.4), зафиксирована основная высокомолекулярная компонента массой 43 кДа и ряд минорных фракций до 20-24 кДа. Количество последних и содержание в них белка изменялись от препарата к препарату. То есть, как и другие препараты канонических ssb-белков /Riva s. et al., 1980; Kovalczykowski s.c. et al., 1981; chase J.W., Williams K.R. et al, 1986; Merrill u.M. et al., 1986/, белки АКЭ характеризуются гетерогенностью, обусловленной протеолизом во время очистки. Действительно, все компоненты ssb-белков имеют структурную гомологию и сходные антигенные свойства /manck s.r., Wilson s.h., 1980; Valentini о. et al-, 1984; 1985," Pandol-fo m. et al ., 1985/. Протеолиз имеет ограниченный характер -не удается получить ssB-белки массой ниже 22-26 кДа Aalentini о. et al1985/. Это подтвердили и наши опыты - выделение ssb -белков из АКЭ с длительным диализом экстрактов (более 36 ч) приводило к получению, в основном, низкомолекулярных форм, но не ниже 20-24 кДа. Однако, при очистке с коротким диализом или вооб-" ще без него, ssB-белки были представлены гтреимуш,ественнно фракцией в 43 кДа (рис.4). То же самое обнаружено и при изоалектроффокусировании - отмечена главная форма с pi = 7,4, которая значительнэлреобладала над другими компон-
ентами. Сделано предположение, что sso-белки ЛКЭ исходно представляют собой высокомолекулярную форму (43 кДа), а содержащиеся в малых количествах низкомолекулярные фракции являются продуктами ее протеолиза.
Связывание с ДНК и РНК. Максимальное сродство ssß-белков к он ДНК (связывание на фильтрах) отмечалось при 0,15- 0,2М Nací . При 0,2М Nací связывание с дн
ДНК было весьма слабым (рис.1). Он ДНК-мо-14
лок конкурировала с / С/-он ДНК Е. coli ! за взаимодействие с ssb-белками в 100 раз сильнее, чем дн ДНК молок. Сходные опыты
по вытеснению / Н/-он ДНК АКЭ из комплекса с ssB-белками немеченой он ДНК АКЭ, ядерной РНК АКЭ и РНК дрожжей показали, что ssB-балки имеют не менее чем 2-х-кра- В1сЛ> c^g^g 5зв-балков с он" тное предпочтение к он ДНК по сравнению ц) и /3||/-ДНК АКЭ
с гомологичной РНК.
Дестабилизация дн ДНК. Эксперименты проведены с помощью разработанного нами метода, основанного на хроматографии на bnd-целлюлозе, дн ДНК с которой алюируется 1М Nací, а ДНК с он участками - 50%-м диметилформамвдом. Ин-
кубация с ssB-белками дн ДНК молок и / Н/-дн ДНК АКЭ с последующим нанесением на bnd-целлюлозу, приводила к снижению количества ДНК в элюате 1М nad с соответствующим повышением количества нуклеиновой кислоты в ашоате диметилформамвдом (в 2-7 раз при весовых соотношениях ssB-балки/ДНК 1-4 и более). Таким образом, ssB-белки АКЭ расплетают дн ДНК.
Влияние на активность ферментов репликации и репарации ДНК. Молекулярная масса и удельная активность ДНК-полимераз<^ \л j¡ из АКЭ составили - около 200 кДа и 7260 ед/мг и 35-38 нДа и 1880 ед/мг соответственно. При гельфильт-рации на G-200 максимум пика активности ДНК-полимеразы o¿ не совпадал с максимумом активности ДНК-репликазы (рис.2). Более того, гют (ATP, С1Р, 6ТР и ИТР) ингибировали полимеразуо^ во всех фракциях, кроме фракции ДНК-реплика-зы (рис.2). Действительно, для АКЭ показано наличие двух форм ДНК-псшимера-зы o¿ - ассоциированной И не ассоциированной С ПраЙмаЗОЙ Ладига т. et al., 1982; 1986/. В качестве ДНК-репликазы использовали фракцию № 5, а полимеразы - № 6 (рис.2).
о^-Аманитин (50-100 мкг/мл) не влиял на активность ДНК-репликазы и гтрай-мазы. ДНК-полимераза oí ингибировалась на 80-90% 20-50 мМ /УдС/, и в 15 раз -
WD кДа KptamuKf.ai-Оосфо 6CH pMl/MJJ, лип<иа\ 6änÄa
Рис.2. Гельфильтрация ДНК-полиме-разы сС на G-200. l-Aggg. 2 и 3 -активность псшимеразы без rNTP и в присутствии rNTP (по 500 мкМ).
1 м?,1 n -этилмалеимидом. 0,2М kaci и n -этилмалеимид почти не снижали активности ДНК-псшиыеразыß , в то время как 0,2М фосфат подавлял ее. В препаратах пслимераэ и ДНК-репликазы отсутствовали примеси зццо- и экзонуклеаз. Таким образом, характеристики полученных ферментов совпадают с литературными данными /Hubscher U., 1983; Grosse F., Krauss G., 1985; Wilson S. et al., 1988; Yagu-ra т. et al., 1982; 1986; Михайлов В. С. и др., 1990/.
esb-белки АКЭ на различных ДЧК-мат-".".цах стимулировали ДНК-псшимеразуе»: из АКЭ (рис.3). Активация на он ДШ может объясняться: 1. Расплетанием ssB-еелка-т участков локальной ренатуращи в да (шпилечных структур); 2. Снижением числа непродуктивных сайтов посадки поли-у.сразы на он ДМ. Показано, что фермент может связываться прочно, но не продуктивно, с он Д!1К, поскольку для катализа необходаыо контактирование полиыеразы с иницилторными 3-0Н-КОНЦаш /Sapp М. et al, 1985/. Покрывая участки непродуктивного связывания, ssb-белки способствует контакту псшимеразы с 3-0Н-концэми.
На активированной ДНК, при малых величинах соотношения ssb-белки/ДНК, отмечается ингио"ироьание (рис.3,г). Активированная ДНК предоставляет собой дн форМУ, имеющую много брешей и коротких участков с он структурой и инициаторккми концами. При малой величине соотношения, белки не обладают расплетающей активностью, но, видимо, покрывают всю он ДНК, в том числе и инициаторше концы, что ингибирует пешимеразу. При увеличении соотношения, ssb-белки становятся способными расплетать дн ДНК, что делает
1.0 1,1" г з ч 5 ь? а
Рис.3. Активность псшимеразы с/ в присутствии £Бв-белков. а,б - денатурированные ДНК АКЭ (3 мкг) и молок (0,6-1? мкг); в - псши(дА) (1,4 мкг); г - ДНК АКЭ, активированная ДНКазой 1 (1,5 мкг).
ее лучшим субстратом для пслимеразы (активация). При осльших величинах соотношения ssb -белки/штрица, и на он, и на актиьированной ДНК отмечается подавление реакции (рис. 3), обусловленное тем, что ssb -белки покрывают не только непродуктивные сайты посадки, но и инициаторные 3-ОН-концы.
ssb -белки стимулировали и ДНК-пслимеразы про!сариот - полимеразу $ага Т4 (в 2 раза) и полимеразу B.stearothermophiius (в 3 раза) на он ДНК. Подобный факт для ssb -белков эукариот показан впервые. Механизм и в этом случае обусловлен, по-видимому, расплавлением шпилечных структур, затрудняющих работу полимераз.
ssb -оелки не изменяли активности ДНК-полимеразы ß на он ДНК, но подавляли фермент на активированной ДНКазой ДНК (при высоких весовых соотношениях ssb -белки/матрица - порядка 4:1 и более).
ssB-бслки ингибировали ДНК-репликазу (ня 4ü-bü¡U и праймазу (2,7 мкг белков полностью подавляли активность). Данные получены для ssb-ослков эукариот впервые. Ранее показан ингибирующий эф1ект ssB-балка t. coli /grosse f., krauss G., 19öb; Kenny м.к. et ai.1989/ и активирующее действие RP-A / Drown G.W. et al., 1992; Matsumoto T. et al -, 1990/ на ПраЙ-мазы животных.
Таким образом, эффекты in vitro ssb-белков на активность ДНК-псяимераз и ДНК-репликазы имели разнонаправленный характер, хотя возможность стимуляции пслимеразы с/. показана однозначно. В системе, более приближенной к in vivo- в проницаемых клетках АКЭ (обработка клеток и ядер слабыми растворами неионных детергентов не изменяет структуру и состав дезоксири-бонуклеопротевда / Hancock ц.»1У74/), ssB-белки в б раз увеличивали интенсивность репликативного синтеза ДНК (см. далее рис. 14).
Сводные данные по характеристике ssß-оелков из объединенного экстракта клеток АКЭ представлены в табл.1.
Сравнение свойств ssb-белков из внехроматиновой фракции и хроматина АКЭ. Ранее ssB-белки типа ИР выделяли либо из внехроматиновои фракции, которая не содержит ядерной ДНК (ссылки см. ЬВьДЬНИЬ), либо из тотального экстракта /Kovalczykowski s.c. et al ., 1981; Jong A.Y.s. et al ., lü8b; chin Y.E. et al., 1994/. Наш проведено сравнение свойств ssb-белков из двух клеточных пулов, в одном из которых они могут быть связаны с ДНК. Не отмечено различий в молекулярных массах (рис.4) и в алигшък свосшах (им-
Характеристика ssß-белков из АКЭ
Таблица 1
Свойство
1. М.м основной компоненты, кДэ (Э$ в ПААГ с Ds-Na)
4. Аминокислотный состав
Относительно низкое содержание ароматики; высокое - Гли и Глу
5. Связывание с ДНК:
а) Число нуклеотадов он ДНК на 1 молекулу (43 кДа)
б) Он ДНК > дн ДНК
в) Кооперативность связывания с он ДНК
г) Он ДНК > FHK
6. Расплетание дн ДНК
" ". Ингибирование экзонуклеазы (фосфодиэс-
теразы змеиного ада)
С. Стьму-шдия ДНК-псшимеразы и
(J. Стимуляция прокариотических ДНК-псшимераз
10. Стимуляция ДНК-полимеразы ^ß
11. Влияние на активность ДНК-репликазы и праймазы
12. Стимуляция репликативного синтеза ДНК в проницаемых клетках АКЭ
13. Примеси ДНК-полимераз, ДЛК-зависишх АТРаз (геликаз), эндо- и экзонуклеаз, ДЦГ и белков НМ6
в 100 раз Не обнаружена Не менее чем в 2 раза Расплетают
Ингибируют Стимулирую? Стимулируют Не стимулируют
Ингибируют
Стимулируют
Отсутствуют
3,6-Ю6 (6-7-ми-даев-ная АКЭ)
муноблоттинг с антисывороткой к Бзв-белкам внехроматиновой фракции) бэв-белков, полученных раздельно из внехроматиновой фракции и хроматина. Не было обнаруаено отличий в связывании Бвв-белков из обоих пулов о он ДЩ двумя ме-■годами - фиксацией комплекса Бзв-белки - / Н/-он ДНК АКЭ на нитроцеллюлоз-ных фильтрах и сорбцией на он ДНК-целлюлозе в пробирках. гэв-белки из обеих фракций одинаково стимулировали репликативный синтез ДНК в проницаемых клетках АКЭ (10-40 мкг белков повышали его интенсивность в 2гЗ раза). Однако, отмечено различное содержание фосфата в препаратах. Прямое определение фосфора показало, что ззв-белки внехроматиновой фракции содержат 2,2-0,1, а хро-
матина - 3,1 - 0,2 мояя фосфата на 1 ноль балка. После инкубации АКЭ 1п VI с /^Р/-ортофосфатом и выделения Ёэв-белков, удельная радиоактивность препаратов различалась практически также (4230 ± 560 и 6430 ± 402 имп/мин/мг; р< 0,05). Са-фосфшипвдзависимая протеинкиназа С и сАУР-зависимая протеин-киназа, хотя и фосфорилировали оба препарата, однако включение фосфата вббв-белки внехроматиновой фракции бшо в 1,5-2 раза более интенсивным (рис.5)»
40 кДа. 30 кДа
Л Ю Ч Г!/!."?[ 31 РJ (М D .1 в ип 1 мпп|SSÜ- бглы"Л
Рис.4. Э£ в ПААГ с Ds-Na ssB-белков внехроматиновой фракции (1) и хроматина (2)
Рис.5. Фосфорилирование ssu-бел-ков внехроматиновой фракции (1) и хроматина (2) протеинкиназой С (а) и сАМР-зависимой протеинкиназой (б).
Оказалось, что фосфорилирование повышает прочность связывания ssb-белков с он ДНК. Через различные промежутки времени инкубации ssB-белков внехроматиновой фракции с сАМР-зависимой протеинкиназой, пробы наносили на колонки с он ДНК-целлшозой. Белки атоировали 0,6М Nací (как при обычном выделении) и, затем, 2М солью. Исходный препарат почти нацело актировался 0,6М Nací , однако, после фосфорилирования белки более прочно связывались с он ДНК и часть их алюировалась 2MNaci (рис.6). Относительное содержание более прочно связанных с он ДНК белков возрастало в процессе фосфорилирования (рис.6).
Увеличение сродства некоторых белков к он нуклеиновым кислотам после фос-форилирования показано и Другими авторами /са1нпаго-ма^1пде н. а1. | 1975; Збарский И.В.. 1988: ниапд к.-р.,ап<зег3зоп е.б., 1994/. Повышение
прочности связывания с он ДНК может объясняться тем, что наряду с электростатическими взаимодействиями в нем принимают участие стэкинг-взаимодействия ароматических аминокислот с основаниями ДНК / Chase j.w., Williams k.r .,1986; Kei-riil в.m. et al-, 1986; 1988/. По-ввдимому, фосфорилирование приводит к TaiaiM конформационным изменениям ssB-белков, которые облегчают стэкинг-взаи-модекствия. Ранее показано, что фосфорилированиеssb-белков снижает их сродство к дн ДНК, хотя белки и не изменяли своей способности связывать на фильтрах он ДНК /otto в. et al., 1977/. Нами также не обнаружено отличий в ко-
личестве / Н/-он ДНК, связываемой на фильтрах ssB-белками внехроматиновой фракции и хроматина, несмотря на их различную степень фосфорилирования. Однако, прочность связывания ssB-белков хроматина с он ДНК, видаю, больше, поскольку эти белки сильнее фосфорилированы. Возможно, эта посттрансляционная модификация является причиной перехода ssB-белков из внехромат"чювой фракции в хроматин, где они могут выполнять свои функции по связыванию с он ДНК.
2. ВВДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА SSB-БЕЛКОВ ИЗ ХРОМАТИНА ГРЕНЫ ТУТОВОГО
Полученные данные до настоящего времени (1996 г.) остаются единственными сведениями о ббв-белках типа ИР насекомых. Выбор в качестве источника выделения только хроматина обусловлен трудностью получения внехроматиновой фракции из грены (наличие твердого хориона, большое количество жира и т.д. /Ку-раниьа О.П. и др., 1985/).
Ву. ".еленные Бзв-белки при ЭФ в ПААГ с пз-иа,как и белки ЛКЭ, характеризовались некоторой гетерогенностью (рис.7). Обнаружены две главные фракции (28 и 31 кДа) и минорные1 компонент(18 кДа; иногда - 22-24 кДа), которые Еарьи-
Рис.6. Влияние фосфорилирования на сродство ББв-бел-ков к он ДНК-целлкшозе. а -зависимость фоофорилирова-ния от времени инкубации с сАЧР-эависимой протеинкина-зой; б - отношение содержания Езв-белков в алюате
ЦЕЛКОПРВДА
ровали от препарата к препарату и объясняется, видимо, протеслизом неходких высокомолекулярных фракций. Бзв-белки [репы были охарактеризованы с применением тех же подходов, что и при и изучении ббв-белков МО. Белки грены несколь ко слабее связывали на фильтрах /^Н/-он АКЭ, чем белки АКЭ, поскольку максимальное взаимодействие отмечено не при
0.15.0,2М N¿01, а при ОДМ ыаС1. В опытах по кокурентному вытеснению /11Н/-он Д1Ж АКЭ дн ДНК молок обнаружено, что зкв-бслки 1рены в 30 раз более прочно связывает1 он да по сравнению с дн матрицей.
Бзв-бепк!! грены обладали способностью дестабилизировать дн ДНК молок и значительно (в 14 раз) стимулировали рсплика-тнвный синтез ДНК в гомологичной системе-в проницаемых ядрах грены (см. далее рис. <4). Как и белки АКЭ, ББи-бслки насекомого активировали прокариотическую ДНК-пал имеразу (флга Т4) на он ДНК (рис.8), причем степень активации (пятикратная) была выше, чем для белков млекопитающих. Видимо, и в этом случае ббв-белки дестабилизи- ^та"ьшш руют участки локальной ренатурации, затрудняющие функционирование ДНК-подимерази. Несмотря на некоторые количественные отличия, в качественном смысле свойства Бяв-белков насекомого (грена) и млекопитающего (АКЭ) были сходни. Характеристика бев-ослкоп грены тутового шелкопряда представлена в табл.2 (ср. с табл.1).
УЛ-оглт гр"ни,пиг
Рис.8. Стимуляция зав-белка-ми грены полимеразы фага Т4
Таблица 2
Характеристика ббв-белков из хроматина грены тутового шелкопряда
Свойство Данные
1. М.м. основных компонент, кДа
(Э£ в ПААГ С Оз-ыа) 31; 28
2. Аминокислотный состав Малое содержание ароматических ос-
татков высокое - Гли и Глу
30 кДа -- г в
17 кДа -----. - //?
12 к/1а --------
I 2 Ню.7. в ПААГ с Дз - кз -белков-маркеров (1) и Баз-оел-ков грены (2),
Таблица 2 (продолжение)
Свойство Данные
3. Связывание с да:
а) Число нуклеотвдов на 1 молекулу (м.м.
принята за 31 кДа) 15
б) Он ДНК > да ДНК _ в 30 раз
в) Кооперативность связывания ■ - " "Не обнаружена
4. Способность дестабилизировать да ДК Дестабилизируют
5. Ингабирование экзонуклеазы Ингибируют
6. Стимуляция ДНК-полимеразы фага Т4 Стимулируют
7. Стимуляция репликативного синтеза ДНК
в ядрах грены Стимулируют
а. Примеси ДНК-полимераз, эндо- и зкзо-
нуклеаз, ЛДГ и белков НМ6 Отсутствуют
3. ВВДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА БСД ИЗ ПЛАЗШ КРОВИ МЛЕКОПИГАЩК-""
Для исследования специфичности эффекта ssB-белков необходимо было выбрат в качестве модели такие полипептады, которые, хотя по некоторым свойствам и были бы сходны с ssB-белками, но заЕедомо не участвовали бы в метаболизме внутриклеточного ДНК. Поэтому и были выбраны БСД плазмы крови.
БСД получены из плазмы крови мышей (исходная концентрация в плазме -13 - 1,5 мкг/мл), поросят (8,1 - 1,5 мкг/мл) и собаки (7 мкг/мл). Препарат БСД бил гомогенным, при 3£ в ПААГ с оз-Na (48 кДа). При гел ¡фильтрации белки локализовались в диапазоне 50-62 кДа. Данные нативного ЕЯ? в ПА" 1 при рН 4,3 и 8,9 показали, что pi БСД находится в кислой области. В препаратах отсутствовали примеси ДНК-полимераз, экзо- и звдонуклеаз.
БСД слабее связывали / Н/-он ДНК АКЗ, чем ssB-белки и, видимо, поэтому слабее ингибировапи экзонуклеазу (фосфодиэстеразу)in vitro . В отличие от ssB-белков, БСД не стимулировали ДНК-полимеразы фага Т4 и В. stearothenraphi lus. Влияния на активность ДНК-полимеразыfl из АКЭ также не обнаружено. Однако, как и ssB-белки, БСД обладали способностью повышать активность ДНК-полимеразы o¿ из АКЭ на он ДНК (рис.9), что может объясняться снижением БСД числа непродуктивных сайтов посадки полимеразы на он ДНК (см. выше).
Ряд свойств сближал БСД с антителами к он ДНК /Поверенный A.M., 1986/: молекулярная масса, которая близка к массе ДНК-связывающего Fab-фрагыента иммуноглобулинов, кислая pi, слабое сродство к ДЭАЭ-целлшозе, относительная теплоустойчивость и уровень в плазме здоровых животных. Как и иммуноглобули-
ны, БСД осаждались 14%-м полиэтиленгликолем, а концентрация. их увеличивалась после инъекции мышам полисахарида, что характерно для антител к ДНК /izui s. et al, 1977/. Уровень БСД повышался при лучевой патологии - выявлено 2-3-х-кратное увеличение его после острого однократного облучения поросят (600 рад; 8-24 ч после воздействия) и 1,4-1,9-ти-кратное повышение концентрации БСД через 24 ч после облучения мышей (400 -900 рад). Таким образом, наиболее вероятно, что БСД являются антителами к он ДНК, стимуляция которыми ДНК-полимеразы оС и ин-шбирование экзонуклеазы выявлены впервые. Антитела, не участвуя в метаболизме внутриклеточной ДНК /Поверенный A.M., 1986/, являются удобной моделью для выявления специфичности 9®t?KTassB -белков.
"у V j " i 6 а ю 12
6С9>, мкг Fiic .9. Влияние БСД поросят (а) и мышей (б) на активность ДНК-полиу.еразы №Э(о<)
4. УЧАСТИЕ Бвв-БЕЛКОВ ЭУКАРИОТ В РЕПЛИКАЦИИ ДНК 4.1. Пропорциональность между размерами ДНК и содержанием Бгв-белков в клетках различных организмов
Если основная функция белков типа ИР обусловлена связыванием с ДНК, то их содержание в клетках различных организмов должно находиться в прямой зависи-
мости от размера генома (табл.3).
Таблица 3
Ввд организма
З"Ю** /Weiner J.H. et al.,1975/;
6-10 (SSB-I) /Jong A.Y.S. et al., 1985/
Гриб Ustilago maydis
Тимус теленка
5,4 /Bollum F.J, 1975/
1* 10 rtluang A.Ta-Fu et al, 1975/
Лимфоциты человека
Миелома мышей АКЭ
1,8-Ю6** 3,6«10ti
Примечание к табл.3, к - /Збарский И.Б., 1988/; хх -/кзшкзукшзй.s.c.et al., 1981/.
Особняком стоят ооциты X.iaevis , где выявлено очень большое содержание 1?
ssb-белков (4*10 молекул /клетку /Carrara g. et al., 1977/. Однако, в развивающиеся ооцитах, вследствие амплификации генов рРНК, суммарное содержание да (ядерной, штохоццриальной и рибосомной) увеличивается в сотни и тысячи раз /Збарский И.Б., 1988/, достигая 3 нг /Carifaca g. et"al ., 1977/. Даже с учетом этих данных, наблвдается корреляция меаду lg двух показателей (табл.3) с г = 0,9.
Количество РР-А в клетках различных организмов не коррелирует с размерами генома и гораздо меньше (до (5-6)»ю\шекул/клетку Жеппу м.к. et al., 1990; Nasheuer н.р. et al., 1992/, причем относительное содержание КР-А (мо-лекул/фг ДНК) ниже показателя Е. сон в 7-52 раза. Уровень RP-A приблизительно равен числу репликонов и молекул ДНК-репликазы, с которой RP-A образует комплекс (ссылки см. ВВВДЕНИЕ). Поэтому, функции по связыванию он ДНК и поддержанию значительных по размерам (см. ВВВДЕНИЕ) участков он ДНК в процессе репликации могут выполнять только белки типа ИР.
4.? Связь ssb -белков с ДНК в хроматине
Клетгл АКЭ с меченой / Н/-тимидином ДНК облучали УФ для индукции ковален-тных сшивок белки-нуклеиновые кислоты (см. МЕТОДЫ). После гвдролиза ДЖ хроматина ДНКазой и выделения ssB-белков, только ssB-белки хроматина облученных клеток имели значительную удельную радиоактивность (табл.4).
Таблица 4
Препарат Удельная радиоактивность, (имп/минНО /иг
Контроль УФ
ssB-белки внехроматиновые ssB-белки хроматина 1,382 - 0,08 1,163 - 0,09 2,31 - 0,44 17,3 - ¿,15 (р<0,05)
В контрольных опытах не отмечено сорбции на он ДНКтцеллкяозе ДНКазы 1 (использованной для гвдролиза ДНК хроматина), поскольку фермент, видимо, связы-
вался с да ДНК-целлюлозой, а также продуктов гидролиза ДНКазой очищенной / Н/-ДНК АКЭ. Поэтому, высокая радиоактивность ssB-белшз хроматина облученных УФ
клеток связана, скорее всего, с ковалетно сшитыми с белками фрагментами / Н/-ДНК, с которой ssB-белки контактируют in vivo. Метод вдентафжации контакта белков с ДНК путем воздействия УФ использовался и другими авторами, причем у белков, сшитых с фрагментами ДНК, слабо изменялась алектрофоретическая под-
ВИЖНОСТЬ /Kenny М.К. et al., 1990; Seroussi Б"., Lavi S-. 1093/. В Наших ОШ1-тах при ЕФ В ПЛАГ С Ds-Na SSB-беЛКОБ хроматина ИЗ контрольных и иийучОКНЫл УФ клеток, различий в злектрофоретической подвижности не выявлено.
Эксперименты по индукции УФ сшивок мевду белками и предварительно проме- i ченнси гяРНК (аналогичные описанным выше; см. также МЕТОДЫ) показали, что удельная радиоактивность выделенных ssB-белкоБ хроматина очень мала и отсутствует разница в показателях для контрольных и облученных клеток. В то же время, во внехроматиновой фракции облученных клеток ssB-белки-были, по-ввди-мому, связаны с фрагментами меченой гяРНК.
Сделан вывод, что ssB-белки в хроматине связаны in vivo с ДНК и только с ДНК (но не с гяРНК).
4.3. Пропорцио1ШЛьность мезду содержанием ssb-белков в хроматине и уровне« репликативного синтеза ДНК
4.3.1. Развитие АКЭ и грены тутового шелкопряда
На рис.10 представлена кинетика роста АКЭ in vivo (а). Репликативний синтез для 3-х-дневной опухоли (параметры которой приняты за 100%) был выше, чем для 5-8-ми- и 10-ти-дневной АКЭ (б). Параллельно изменениям репликации снижалось содержание ssB-белкоБ в обеих фракциях (в,г). Способность ssB-белков связывать он ДНК при этом не изменялась.
На рис.11 представлены соответствующие опыты с греной, развитие которой происходило при перенесении в соответствующие температурные условия от диапаузы (день "О") через фазу максимальной пролиферации (5 день) до конечной стадии формирования высокодифференцировашшх тканей зародыша /Клименко В.В., 1975/. ■ Содержание зэв-белков в хроматине грены коррелировало с репликативным синтезом ДНК в ядрах (г= 0,99), причем максимальным изменениям подвергалась основная фракция ssb-балков (28-31 кДа).
Таким образом, количество ssB-белков в хроматине связано с уровнем репликации ДНК. Подобные данные для охарактеризованных ssB-белков получены впервые. В то жеегсмя;. уровень КР-А не изменяется на разных стадиях щеточного
2 Ч 6 в 10 Лии /
§?0-белкн, мкг/г ядер
Включение
(имп/мин)* IÖ3 на мг белка
ЦИКЛа /01г\ Б. еС а1., 1990; Бегоизз1 Г. Б. б., 1993/. Возможно, повышение уровня бзй-белков в хроматине про-лиферирувдх клеточных популяций обусловлено фосфорилированием этих белков щклин-зависимыми протеинкиназами, участвующими В пролиферативном сигнале,Ва1а1п V. еЬ а1 ., 1993; Иезп^гку а1 . > 1995/. Фосфорилирование может повышать прочность связывания ББв-белков с он ДЩ (см. 1) и, как следствие, увеличивать их содержание в хроматине. С другой стороны, содержание Бзв-белков может зависеть от количества участков с он ДНК, которое повышается в прсли£ерирующих клетках.
4.3.2. Ингибирование репликативного синтеза ДНК
Дни развития
При инкубации АКЭ in vitro 30 ч обнаружено снижение репликации ДНК (рис.
Включение ЛН/-тими-
12 а). Возможно, культуральная среда оказывается недостаточной дня АКЭ. Клетки снижают репли-кативную активность, не делятся, хотя полностью сохраняют жизнеспособность и целостность (см. МЕТОДЫ) . Параллельно снижению репликации, наблвдаются аналогичные изменения уровня ssb-белков в хроматине (б) с соответствующим повышением во внехроматиновой фракции (в). Период полужизниssb-белков, по-видимому, достаточно длителен -
Btc.12. Инкубация АКЭ in vitro.
"ssB-белки хроматина, мкг/108 клеток
внехрома-
нами не обнаружено распада промечених in vivo ssD-белков при инкубации АКЭ в течение 10 ч (см.МЕТОДЦ). При солировании результатов всех опытов in vivo и in vitro , в которых параллельно исследовали содержание ssB-белков в хроматине АКЭ и интенсивность репликативного синтеза ДНК, получена прямо пропорциональная зависимость мевду этими параметрами (г = 0,9). Для суммарных ssb-белков АКЭ такой закономерности не отмечено.
4.3.3. Активация репликативного синтеза ДНК
Клетки костного мозга мышей инкубировали (45 мин, 37°, 0.15М Nací с 20 мМ НЕРЕЗбуфером, рН 7,4) с цинк-МТ, для которою предполагается участие в меи-клеточном транспорте цинка /ihomas d.g. et al., 1937/ и, в качестве его донора, в пролиферации /Vaiiee B.L ., 1991/. Выбор АКЭ в качестве объекта в этом случае оказывался неоправданным, поскольку опухоль имеет высокий и постоянный уровень цинка при развитии /Kraker A.J. et al-, 1988/.
Обнаружено зависимое от количества цинк-МТ повышение уровня реш.нкыполого синтеза и содержания ssu-белков в хроматине (рис.13). Поскольку в.составе SSB-белков мышей (АКЭ) не обнаружено цистеина (компонента ДНК-связывающих участков ("цинковых пальцев") факторов метаболизма ДНК / Vallee B.L, 1991/), ВЛИЯНИе ЦИНК-МГ вряд ли связано с модуляцией ДНК-связывающей активностью ЯВ-бслков. Возможно, увеличение их уровня обусловлено повышением количества ДНК с он участками при
Ü 50 ТОО ¡5Í 7
Дпнк-МТ, гдкг/10 клеток
стимуляции репликации ДНК цинк-МГ
по другим механизмам.
4.4. Спещфмность стимуляции ssb-белками репликативного синтеза ДНК..
Специфичность ssB-белиэв для клетоп млекопитающих и насекомых
Представленные данные в совокупности доказывают участие ssû-белков в репликации ДНК, однако механизм их действия оставался не ясным. И другие поли-аептиды при тех или иных условиях in vitro стимулируют ДНК-полимеразу оС (БСД. ДДГ /Kaiserman H.В. et al., 1989/, беЛКИ НМ6 /Marekov L.N. et-al., " 1984/, продукты протесшиза нуклеолинаvsapp м< et al., 1985/, но не белки iïiPHn-частиц /Riva s. et ai., 198o/). Однако, в опытах с проницаешми клетками и ядрами, то есть, в условиях, приближенных к in vivo, обнаружено, что эффект ssB-белкоБ, по-ввдимому, специфичен (рис.14). Максимальный уровень активации отмечен в гомологичных системах, а в гетерологичныхэзв -белки проявляли слабый эффект, сравнимый с действием БСД. Белки АКЭ стимулировали синтез ДНК в клетках АКЭ начиная с количества 3,5 мкг, что всего в 1,5 раза превышает уровень эндогенных белков. Относительно слабая стимуляция БСД и ssa-белками в гетерологич-ных системах, видимо, неспеци£ична и объясняется снижением числа непродуктивных сайтов посадки полимеразы oi на он ДНК (см. 1). Таким образом, активация репликации ДНК, возможно, специфична для ssü-белков и требует гомологичного дезоксирибонуклеопротезда. Другие исследованные на этот предмет белки не обладают подобным свойством. Так, белок Н".ё 1 в проницаемых клетках увеличивал репликативный синтез всего в 1,5 раза /Mexandrova E.A.et рис.14. Стимуляция репликативного син-ai., 1984/ (что сравнимо с БСД), а теза ДНК в проницаемых клетках АКЭ (а) белки гяРНП-частиц не активируют ДНК- и ядах грены (б) ssB-белкаш АКЭ (1), полимеразу. Доя RP-A данные нам ^ны (2) и БСД (3). неизвестны.
Степень активации
Балки, мкг
Стимуляция репликации оказалась специфичной для ssß-белков млекопитающих и насекомых (рис.14). Аминокислотный состав их, хотя и имел общие черты (и был сходен с составом.других белков, связывающихся с он ДНК и РНК), однако имел и существенные отличия. Иммуноферментныи анализ с антисывороткой к ssb-белкам АКЭ показал, что белки АКЭ и грены не имеют общих антигенных"детерминант. Иммуноблоттинг продемонстрировал, что антитела к ssB-белкам АКЭ не реагируют с лабильно связанными негистоновыми оелками хроматина (где находятся белки НМ6 /Збарский И.В., 1988/) и основными коровыми белками гяРНП-час-тиц. В то же время, в составе гяРНП-частиц АН1> наш обнаружена илнорная фракция, взаимодействующая с антителами. По-видимому, в хроматине ssB-белки участвуют в репликации, стабилизируя он ЖК, защишдя ее от нуклеаз и модулируя ДНК-полимеразы,- а во внехроматиновой фракции ммут входить в качестве минорных компонент в состав гяРНП-частиц и быть связанными с гяРНК (см. 4.2).
Эффект ssB-белков и RP-A на репликацию ДНК в клетках имеет, скорее всего, комплексную природу. Можно предположить, что на начальной стадии KP-А, связываясь с праймазной субъединицей ДНК-репликазы, стимулирует инициацию. Такой комплекс RP-A - праймаза становится нечувствительным к ингибированию каноническими sss-белками (которое показано нами в опытах с ssB-белками и выделенной ДНК-репликазой - см. табл.1). Происходит инициация репликации. Далее, на стадии элонгации, принимают участие белки типа HP, количество которых в клетках значительно больше, чем №-А (см. 4.1).
5. УЧАСШЕ ssb -БЕЛКОВ В РЕПАРАЦИИ ДНК ПОСЛЕ ВСВДЙСПВИЯ УФ И ИЗЛУЧЕНИЯ НА АКЭ
Кривая выживаемости АКЭ после воздействия УФ (1,53-40 Дж/А характеризуется следующими параметрами: ¡¡^ = 9 Дж/ьГ, Д^у = 11,0 Дж/м^, Д = 4 Дж/м*" и = 1,03, а после воздействия у-излучения (3-20 1р) - 4,4 Гр, 8 1р, 3,8 11? и 2,4 соответственно.
На рис.15 представлена зависимость корректированного (см. МКЮДУ) репара-тивного синтеза и содержания ssß-белков от времени после облучения УФ. Пик повышения количества ssB-белков в хроматине совпадает с максимумом репара-тивного синтеза. Поскольку на содержании ssB-белков отражаются колебания и в регшикативном синтезе (см. 4.3), который изменялся по экспоненциальному закону, наблюдается уменьшение уровня ssß-белков в ранние и поздние сроки после воздействия (рис.15). Изменения количества ssB-белков во внехроматиновой фракции были обратны колебаниям в хроматине (рис.15) и суммарное содержание их оставалось постоянным. Через 2,Ь ч после облучения уровень 5-ь-белков в хроматине повышался в зависимости от дозы излучения (1,53-20 Дж/А.
Рис.1Ь. Репаративный синтез ДНК (1), ордината справа, и содержание ssB-белкоз в хроматине (2) и внехроматиновой фракции (3), ордината слева,
после облучения АКЭ УФ (10 р
Дк/м) и инкубации in vitro . Штриховка (здесь и далее) -зона максимального ш для уровня ssb-белков в контроле.
Репаративный синтез,
На рис.16 представлены соответ ствутеие значения для АКЭ после воздействия ^-радиации в дозе время после облучения, ч 15 Гр. Увеличение сепаративного
включения / Н/-тимидина отмечено через 1 ч и, затем, через 6-9 ч после воздействия ("быстрая" и"медленная" компоненты репарации /Пелевина И.И. и др., 1985/Л Количество ббв -белков в хроматине изменялось в соответствии с колебаниями репаративного синтеза. Видимо, относительно небольшое снижение репликацци, обнаруженное нами (на 30-40%) при действии облучения, не отражается существенно на уровне бэв-белков в хроматине. Как и в случае воздействия УФ, содержание ббв-белков через 6 ч. после облучения ионизирующей радиацией (5-15 Гр) было пропорционально дозе излучения.
И после воздействия УФ, и ^-радиации, накопление ББВ-белков в хроматине не было напрямую связано с повышением содержания ДНК с он участками, которое увеличивалось относительно слабо (на 10-15%) и находилось на постоянном уровне спустя 1 ч и далее после воздействий.
Для исследования влияния ББв-белков на репаративный синтез, АКЭ облучали УФ (20
Дж/м^), инкубировали 2 ч и, затем, получали препарат проницаемых клеток. Ин-
Рис.16. Репаративный синтез ДНК (1) и содержание Бэв-бел-ков в хроматине (2) после действия ^-радиации (15 П?). Обозначения ординат как на рис. 15.
кубация последних с ssB-беяками приводила к увеличению интенсивности репа-ративного синтеза ДНК (ö vier ssB-белков - до 13V ± "/%, lü мкг - до 215 - 5% (р< ü,0b) и 24 мкг - до 248 ±8% (р< 0,05) от контроля без белков). Таким образом, ssB-белки принимают участие в репарации ДНК после облучения.
Механизм действия белков в этом процессе может быть связан с их фосфори-лированием после облучения (как это показано для многих белков хроматина /Блюм Я.В., 1987/), что приводит к повышению прочности связывания ssb -белков с он ДНК. Влияние ssB-белков на репарацию реализуется, видимо, на уровне активации ДНК-полимеразы, которая, наряду с другими полимеразами (Ji /Уап Z.-J., Roy D ., 1996/, /Dc-esler S.L. et al ., 1УЬ8/ И £ /schivji м.к.к. et al ., 199t>/) участвует в этом процессе, осуществляя застройку коротких брешей В НИТИ ДНК /Cleaver J., 1УЪ4; Mirzayans К. et al.jyy^/,
1. Из клеток АКЭ и грены тутового шелкопряда выделены ssB-оелки, которые бьши охарактеризованы по основным физико-химическим параметрам (аминокислотный состав, молекулярная масса, изоалектрическая точка (для белков из АКЭ), связывание с однонитевыми и двунитевыми нуклеиновыми кислотами, способность расплетать двойную спираль ДНК) и биохимическим свойствам (отсутствие примесей ферментов метаболизма ДНК, белков Нмё, ДНК-связивающеи формы ЛДГ, способность ингибировать экзонуклеазу). Разработан метод количественного определения sse-белков в клетках зукариот и продемонслри(.ювана его корректность.
2. Показано, что ssB-оелки АКЭ способны стимулировать гомологичную ДНК-полимеразу; при больших весовых соотношениях ssu-оелки/он ДНК отмечается ингибирование. ssb-белки АКЭ не изменяли активности ДНК-полимеразы^ на он ДНК но ингибировали фермент на активированной ДНК при больших весовых соотношениях ssb -белки/матрица.
3. ssb -белки АКЭ ингибировали гомологичные ДНК-репликазу и праймазу.
4. ssb -белки из АКЭ и грены тутового шелкопряда активировали прокариоти-ческие ДНК-полимеразы.
5. ssB-белки из АКЭ и грены тутового шелкопряда в клетках АКЭ и ядрах грены, проницаемых для макромолекул, стимулировали репликативный синтез ДНК. Максимальная степень активации отмечена в гомологичных системах, белки из плазмы крови, связывающиеся с он ДНК, не имитировали эффекты ssb-белков на субклеточном уровне, хотя на молекулярном уровне были способны стимулировать ДНК-полимеразу из АКЭ на он ДНК.
6. ssB-белки из внехроматиновой фракции и хроматина клеток АКЭ бьши иден-
тичны по всем основным свойствам, за исключением степени фосфорилирования, которая бьша выше для ssB-белков хроматина в 1,4-1,5 раза. Вследствие этого, ssB-белки внехроматиновой фракции фосфорилировались сАМР-завис, ■: юй протеин-киназой и протеинкиназой С белее интенсивно. Фосфорилирование ssB-белкоа из АКЭ сАМР-зависимой протеинкиназой повышало прочность связывания их с он ДНК.
V. Показано, что in vitro ssB-белки АКЭ связаны в хроматине с ДНК и только с ДНК. Во внехроматиновой фракции возможен контакт с гяРНК.
8. Интенсивность репликативного синтеза ДНК в клетках АКЭ и ядрах грены тутового шелкопряда тесно коррелирует с содержанием ssB-белков в хроматине (г равны 0,9 и 0,99 соответственно). Подавление репликации ДНК в клетках АКЭ сопровождается снижением уровня ssB-белков в хроматине. Стимуляция реп-лихат^вчого синтеза ДНК цинк-Mi" в клетках костного мозга мышей приводит к парагл влькому увеличению содержания ssß-белков в хроматине.
9. Уровень репаративного синтеза ДНК в клетках АКЭ после воздействия УФ
и у-излучения коррелирует с количеством ssB-белков в хроматине. Гомологичные ssB-белки при добавлении к облученным клеткам АКЭ, проницаемым для макромолекул, активируют репаративныи синтез ДНК.
10. ssB-белки типа ИР являются специ$ичной группой нешетоновых белков хроматина, участвующих в репликации и репарации ДНК, которая отличается от других групп белков, связывающих однонитевые нуклеиновые кислоты. ssB-белки характеризуются относительно низкой степенью консервативности, поскольку отличны для клеток насекомых и млекопитающих.
1. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Влияние белка, связывающего однонитчатую ДНК (ssß-белка) на некоторые ферменты репликативного комплекса из клеток асцитной карциномы Ерлиха. Тез.докл. IX Всес. симп. "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка, май 1987, с.229.
2. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Effect of single--cranded DNA-binding protein (SSB-protein) on the activity of some enzymes of the replicative complex. Intern. Symp. "Physico-chemistry of DNA and molecule niochanisins of genome functioning". /detracts. Ibi-lisii 1967, p. 120-121.
Ь. аотеров A.H., Новорадовская H.A., Золотарева Л.А., Филиппович И.В. Влияние радиации на белки, стабилизирующие однонитчатую структуру ДНК. Ин£ормац. бкшл. АН СССР по проблемам радиобиологии, вып.34. М, 1987, с.35.
4. Чиркова Л.П., Власов М.С., Золотарева Л.А., Котеров А.Н. Некоторые аспекты изучения радиационного поражения ДНК. В кн.: "Радиобиологический эксперимент и человек". Сб.тр. Института биофизики МЗ СССР/Под ред. Ю.И. Москалева. М., 1987, с.88-93.
5. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Влияние ионизирующей радиации на содержание ДНК-связывакхцего белка в плазме крови млекопитающих. FVK-деп. в ВИНИТИ № 1388-В-88 от 22.02.1988 г.
6. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Тронов В.А., Золотарева Л.А., Филиппович И.В. Выделение и характеристика белка, связывающегося с однонитевой да (ssB-белка) из ¡слеток асцитной карциномы Эрлиха. Биохимия., 1988. Т.53, №7. С. 1193-1202. .
7. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Влияние ssB-белка из клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на активность некоторых ферментов репликации и репарации ДНК. Биохимия. 1988. Т.53. №8. С.1278-1287.
8. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Участие ssB-белка в репарации ДНК клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) после облучения УФ и ионизирующей радиацией. Тез. докл. 1 Всес. радиобиол. съезда. М.: 1989, т.1, с.120-121.
9. Филиппович И.В., Котеров А.Н. Белки, связывающиеся с однонитевой ДНК (ssB-белки): свойства и возможные функции в клетках эукариот (обзор). Успехи соврем.биол. 1989. Т. 107. №2. С.163-178.
10. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Участие ssB-белка в репарации ДНК шгеток асцитной карциномы Ерлиха (АКЭ) после облучения УФ. Радиобиология. 1989. Т.29. № 6. С.723-728.
11. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Участие ssB-белка в репарации ДНК клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) после у-облучения. Радиобиология. 1989. Т.29. № 6. С.729-731.
12. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Участие белка, связывающегося с однонитевой ДНК (ssB-белка) в репликации ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Биохимия. 1990. Т.55. № 3. С.911-916.
13. Новорадовская H.A., Котеров А.Н. Белки плазмы крови млекопитающих, связывающиеся с одноцепочечной ДНК; влияние на реакции полимеризации и деградации ДНК. Укр.биохим.журн. 1990. Т.62. Р 3. С.31-37.
14. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Экспресс-метод оп-редления количества белков, связывающих ДНК, в сыворотке крови млекопитающих. Вопр. мед. химии. 1990. Т.36. № 4. С.85-88.
15. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Участие белка, связывающегося с однонитевой ДНК (ssB-белка) в репарации ДНК клеток асцитной опухали Е£лиха (АСВ) после облучения УФ-светом и ионизирующей радиацией. Тез.докл. Всес. симп. "Биохимия опухолевой клетки". Минск, ноябрь 1990,
16. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Применение экспресс-метода определения количества белков, связывающихся с ДНК (БСД) для диагностики злокачественных новообразований. Тез.докл. Всес. симп. "Биохимия опухолевой клетки". Минск, ноябрь 1990, с.142-143. "
17. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Пушкарева Н.Б., Воротников A.B., Никсшьский A.B., Рисник В.В. Фоофорилирование и другое свойства белков, ■ связывающихся с однонитевой ДНК (ззв-белков) ,из.хроматина и внехроматино-вой фракции клеток асцитной карциномы флиха. Биохимия. 1991. Т.56. № 4. С.666-673.
18. Котеров А.Н., Андрианова Е.П., Филиппович И.В. Метод определения количества белков, связывающихся с однонитевой ДНК (ssB-белков) в грубом экстракте клеток эукариот. Рук. деп. в ВИНИТИ № 2154-В-91 от 23.05.91 г.
19. Котеров А.Н., Сазыкин А.Ю., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Антигенные свойства белков гетерогенных ядерных рибонуклеопротевдных частиц, лабильно связанных негкстоновых белков и белков, связывающихся с однонитевой ДНК (белков ssb) из асцитной опухали Эрлиха. Укр.биохим.журн. 1991. Т.63. № 5. С.26-32.
20. Тронов В.А., Зайцев В.А., Черный Д.И., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Связывание ssß-белка из клеток асцитной карциномы Эрлиха с ДНК и полирибо-нуклеотвдами. Мол. бися. 1991. Т.25. №1. С.212-222.
21. Котеров А.Н., Никольский A.B., Пушкарева Н.Б., Рисник В.В. цАМФ-за-висимое фоофорилирование белков, связывающихся с одноцепочечной ДНК (ssb-белков) как возможный модулятор процесса репарации ДНК после облучения УФ-светом и ионизирующей радиацией. Тез. докл. 1У Всес. конф. "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды". Ленинград, сентябрь 1991, с. 123.
22. Котеров А.Н., Андрианова Е.П., Филиппович И.В. Стимуляция реггликатив-ного синтеза ДНК белками эукариот, связывающимися с однонитевой ДНК. Укр. биохш.журн. 1992. Т.64. № 1. С.35-41.
23. Котеров А.Н., Ацдрианова Е.П., Филиппович И.В. Использование хроматографии на бензоил-нафтил-ДЭАЭ-целлюлозе для определения способности белков из асцитной карциномы Эрлиха, связывающихся с однонитевой ДНК (ssß-белков), десто.ллиз:фовать двойную спираль ДНК. Биохимия. 1992. Т.57. № 2.С.195-200.
24. Андрианова Е.П., Тарасенко Н.В., Котеров А.Н., Филиппович Ю.Б. Белки. грены тутового шелкопреда, связывающиеся с однонитевой ДЩ (ssB-белки): выделение и свойства. Биохимия. 1992. Т.57. № 3. С.398-405.
25. Котеров Л.Н., Рисник В.В. Связь ssu-белков с да б хроматине клеток асцитной 1сарцинош Эрлиха. Биохимия. 1992. Т.57. №7. С.1083-1088.
26. Koterov A.N.< Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. The relationship of single-stranded DNA-binding proteins of the Ehrlich asfcites tumor to cell growth phase and DNA replication. Indian J. Biochem. Biophys. 1992. V.29.
27. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Nikpl"skii A.V., PushXareva N.B., Vorotnikov A.V.» Risnik V.V. Properties of single-stranded DNA-binding proteins (SSB-proteins) from chromatin and nonchromatin fraction of Ehrlich ascites tumour. Phosphorylation enhances the affinity of SSB-proteins for single-stranded DNA. Indian J. Biochem. Biophys. 1992. V.29. N 1. P.13-19.
28. Котеров A.H., Сазыкин A. 10., Филиппович И.В. Снижение острой токсичности этанола препаратом цинк-металлотионеина /выделение и характеристика цинк-металлотионеина/. Бюл. экспер. бисш. 1993. Т.115. № 1. С.39-40.
29. Котеров А.Н. Возможность участия белков, связывающихся с однонитевой ЛИК, в репликации да у эукариот (обзор). Укр.биохим.журн. 1994. Т.66. N° 2. С.17-30.
30. Котеров А.Н., "Гребенок З.А., Пушкарева Н.Б., Никольский А.В. Стимуляция экзогенным цинк-металлотионеином репликативного синтеза ДНК и пролиферации клеток костного мозга у облученных мышей. Тез. докл. конф. "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы". Москва, ноябрь 1995, с.11-12.
31. Котеров А.Н., Филиппович И.В. Радиобиология металлотионеинов (обзор). Рэдиац.биоп. Радиоэкся. 1995. Т.35. № 2. С.162-178.
32. Котеров А.Н., Требенок З.А., Пушкарева Н.Б., Никольский А.В. Стимуляция экзогенным цинк-металлотионеином репликативного синтеза ДНК и пролиферации клеток костного мозга мышей. Бюл. экспер. бисш. 1996. Т.122. tP-i2. С.
33. Котеров А.Н. Влияние цинк-металлотионеина на репликативный синтез ДНК и содержание белков, связывающихся с однонитевой ДНК (белков ssb) в хроматине клеток костного мозга мышей. Укр.биохим.журн. 1996. Т.бУ. С.
В публикациях, отражающих основные материалы работа, участие соавторов заключалось в совместном с диссертантом проведении части экспериментов, что отражено в разделе МАТЕРИАЛЫ И МЕГОДЫ. Личный вклад диссертанта состоял в -пределении задач, разработке основных подходов, напраапений и методов исследования, самостоятельном проведении большей части экспериментов, литературном поиске, анализе и обобщении полученного материала.
Белки являются строительным материалом организма и участвуют в процессе метаболизма. Функции белков в организме имеют огромное значение для поддержания жизнедеятельности.
Строение
Белки - биополимеры, состоящие из отдельных звеньев - мономеров, которые называются аминокислотами. Они состоят из карбоксильной (-СООН), аминной (-NH2) группы и радикала. Аминокислоты связываются между собой с помощью пептидной связи (-C(O)NH-), образуя длинную цепочку.
Обязательные химические элементы аминокислот:
- углерод;
- водород;
- азот;
- кислород.
Рис. 1. Строение белка.
Радикал может включать серу и другие элементы. Отличаются белки не только радикалом, но и количеством карбоксильной и аминной групп. В связи с этим выделяют три типа аминокислот:
- нейтральные (-СООН и -NH2);
- основные (-СООН и несколько -NH2);
- кислые (несколько -СООН и -NH2).
В соответствии с возможностью синтезироваться внутри организма выделяют два вида аминокислот:
ТОП-2 статьи которые читают вместе с этой
- заменимые - синтезируются в организме;
- незаменимые - не синтезируются в организме и должны поступать из внешней среды.
Известно около 200 аминокислот. Однако в построении белков участвуют только 20.
Синтез
Биосинтез белков происходит на рибосомах эндоплазматической сети. Это сложный процесс, состоящий из двух стадий:
- образование полипептидной цепи;
- модификация белка.
Синтез полипептидной сети происходит с помощью матричной и транспортной РНК. Этот процесс называется трансляцией. Вторая стадия включает «работу над ошибками». Части синтезированного белка заменяются, удаляются или удлиняются.
Рис. 2. Синтез белка.
Функции
Биологические функции белков представлены в таблице.
|
Функция |
Описание |
Примеры |
|
Транспортная |
Переносят химические элементы к клеткам и обратно во внешнюю среду |
Гемоглобин переносит кислород и углекислый газ, транскортин - гормон надпочечников в кровь |
|
Двигательная |
Помогают сокращаться мышцам многоклеточных животных |
Актин, миозин |
|
Структурная |
Обеспечивают прочность тканей и клеточных структур |
Коллаген, фиброин, липопротеины |
|
Строительная |
Участвуют в образовании тканей, мембран, клеточных стенок. Составляют мышцы, волосы, сухожилия |
Эластин, кератин |
|
Сигнальная |
Передают информацию между клетками, тканями, органами |
Цитокины |
|
Ферментативная или каталитическая |
Большинство ферментов в организме животных и человека имеют белковое происхождение. Они являются катализатором многих биохимических реакций (ускоряют или замедляют) |
Ферменты |
|
Регуляторная или гормональная |
Гормоны белкового происхождения контролируют и регулируют процессы метаболизма |
Инсулин, лютропин, тиротропин |
|
Генно-регуляторная |
Регулируют функции нуклеиновых кислот при переносе генетической информации |
Гистоны регулируют репликацию и транскрипцию ДНК |
|
Энергетическая |
Используется как дополнительный источник энергии. При распаде 1 г высвобождается 17,6 кДж |
Распадаются после исчерпывания других источников энергии - углеводов и жиров |
|
Защитная |
Специфичные белки - антитела - предохраняют организм от заражения, уничтожая чужеродные частицы. Особые белки сворачивают кровь, останавливая кровотечение |
Иммуноглобулины, фибриноген, тромбин |
|
Запасающая |
Запасаются для питания клеток. Удерживают необходимые организму вещества |
Ферритин удерживает железо, казеин, глютен, альбумин запасаются в организме |
|
Рецепторная |
Удерживают различные регуляторы (гормоны, медиаторы) на поверхности или внутри клетки |
Глюкагоновый рецептор, протеинкиназа |
Белки могут оказывать отравляющее и обезвреживающее действие. Например, палочка ботулизма выделяет токсин белкового происхождения, а белок альбумин связывает тяжёлые металлы.
Ферменты
Стоит сказать кратко о каталитической функции белков. Ферменты или энзимы выделяют в особую группу белков. Они осуществляют катализ - ускорение протекания химической реакции.
В соответствии со строением ферменты могут быть:
- простыми - содержат только аминокислотные остатки;
- сложными - помимо белкового мономерного остатка включают небелковые структуры, которые называются кофактором (витамины, катионы, анионы).
Молекулы ферментов имеют активную часть (активный центр), связывающую белок с веществом - субстратом. Каждый фермент «узнаёт» определённый субстрат и связывается именно с ним. Активный центр обычно представляет собой «карман», в который попадает субстрат.
Связывание активного центра и субстрата описывается моделью индуцированного соответствия (модель «рука-перчатка»). Модель показывает, что фермент «подстраивается» под субстрат. Благодаря изменению структуры снижаются энергия и сопротивление субстрата, что помогает ферменту легче перенести его на продукт.
Рис. 3. Модель «рука-перчатка».
Активность ферментов зависит от нескольких факторов:
- температуры;
- концентрации фермента и субстрата;
- кислотности.
Различают 6 классов ферментов, каждый из которых взаимодействует с определёнными веществами. Например, трансферазы переносят фосфатную группу от одного вещества к другому.
Ферменты могут ускорять реакцию в 1000 раз.
Что мы узнали?
Выяснили, какие функции выполняют белки в клетке, как они устроены и как синтезируются. Белки представляют собой полимерные цепочки, состоящие из аминокислот. Всего известно 200 аминокислот, но белки могут образовывать только 20. Белковые полимеры синтезируются на рибосомах. Белки выполняют важные функции в организме: переносят вещества, ускоряют биохимические реакции, контролируют процессы, происходящие в организме. Ферменты связывают субстрат и целенаправленно переносят его на вещества, ускоряя реакции в 100-1000 раз.
Тест по теме
Оценка доклада
Средняя оценка: 4.6 . Всего получено оценок: 367.
К нуклеиновым кислотам относят высокополимерные соединения, распадающиеся при гидролизе на пуриновые и пиримидиновые основания, пентозу и фосфорную кислоту. Нуклеиновые кислоты содержат углерод, водород, фосфор, кислород и азот. Различают два класса нуклеиновых кислот: рибонуклеиновые кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) .
Строение и функции ДНК
ДНК — полимер, мономерами которой являются дезоксирибонуклеотиды. Модель пространственного строения молекулы ДНК в виде двойной спирали была предложена в 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком (для построения этой модели они использовали работы М. Уилкинса, Р. Франклин, Э. Чаргаффа).
Молекула ДНК образована двумя полинуклеотидными цепями, спирально закрученными друг около друга и вместе вокруг воображаемой оси, т.е. представляет собой двойную спираль (исключение — некоторые ДНК-содержащие вирусы имеют одноцепочечную ДНК). Диаметр двойной спирали ДНК — 2 нм, расстояние между соседними нуклеотидами — 0,34 нм, на один оборот спирали приходится 10 пар нуклеотидов. Длина молекулы может достигать нескольких сантиметров. Молекулярный вес — десятки и сотни миллионов. Суммарная длина ДНК ядра клетки человека — около 2 м. В эукариотических клетках ДНК образует комплексы с белками и имеет специфическую пространственную конформацию.
Мономер ДНК — нуклеотид (дезоксирибонуклеотид) — состоит из остатков трех веществ: 1) азотистого основания, 2) пятиуглеродного моносахарида (пентозы) и 3) фосфорной кислоты. Азотистые основания нуклеиновых кислот относятся к классам пиримидинов и пуринов. Пиримидиновые основания ДНК (имеют в составе своей молекулы одно кольцо) — тимин, цитозин. Пуриновые основания (имеют два кольца) — аденин и гуанин.
Моносахарид нуклеотида ДНК представлен дезоксирибозой.
Название нуклеотида является производным от названия соответствующего основания. Нуклеотиды и азотистые основания обозначаются заглавными буквами.
Полинуклеотидная цепь образуется в результате реакций конденсации нуклеотидов. При этом между 3"-углеродом остатка дезоксирибозы одного нуклеотида и остатком фосфорной кислоты другого возникает фосфоэфирная связь (относится к категории прочных ковалентных связей). Один конец полинуклеотидной цепи заканчивается 5"-углеродом (его называют 5"-концом), другой — 3"-углеродом (3"-концом).
Против одной цепи нуклеотидов располагается вторая цепь. Расположение нуклеотидов в этих двух цепях не случайное, а строго определенное: против аденина одной цепи в другой цепи всегда располагается тимин, а против гуанина — всегда цитозин, между аденином и тимином возникают две водородные связи, между гуанином и цитозином — три водородные связи. Закономерность, согласно которой нуклеотиды разных цепей ДНК строго упорядоченно располагаются (аденин — тимин, гуанин — цитозин) и избирательно соединяются друг с другом, называется принципом комплементарности . Следует отметить, что Дж. Уотсон и Ф. Крик пришли к пониманию принципа комплементарности после ознакомления с работами Э. Чаргаффа. Э. Чаргафф, изучив огромное количество образцов тканей и органов различных организмов, установил, что в любом фрагменте ДНК содержание остатков гуанина всегда точно соответствует содержанию цитозина, а аденина — тимину («правило Чаргаффа» ), но объяснить этот факт он не смог.
Из принципа комплементарности следует, что последовательность нуклеотидов одной цепи определяет последовательность нуклеотидов другой.
Цепи ДНК антипараллельны (разнонаправлены), т.е. нуклеотиды разных цепей располагаются в противоположных направлениях, и, следовательно, напротив 3"-конца одной цепи находится 5"-конец другой. Молекулу ДНК иногда сравнивают с винтовой лестницей. «Перила» этой лестницы — сахарофосфатный остов (чередующиеся остатки дезоксирибозы и фосфорной кислоты); «ступени» — комплементарные азотистые основания.
Функция ДНК — хранение и передача наследственной информации.
Репликация (редупликация) ДНК
— процесс самоудвоения, главное свойство молекулы ДНК. Репликация относится к категории реакций матричного синтеза, идет с участием ферментов. Под действием ферментов молекула ДНК раскручивается, и около каждой цепи, выступающей в роли матрицы, по принципам комплементарности и антипараллельности достраивается новая цепь. Таким образом, в каждой дочерней ДНК одна цепь является материнской, а вторая — вновь синтезированной. Такой способ синтеза называется полуконсервативным .
«Строительным материалом» и источником энергии для репликации являются дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), содержащие три остатка фосфорной кислоты. При включении дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в полинуклеотидную цепь два концевых остатка фосфорной кислоты отщепляются, и освободившаяся энергия используется на образование фосфодиэфирной связи между нуклеотидами.
В репликации участвуют следующие ферменты:
- геликазы («расплетают» ДНК);
- дестабилизирующие белки;
- ДНК-топоизомеразы (разрезают ДНК);
- ДНК-полимеразы (подбирают дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и комплементарно присоединяют их к матричной цепи ДНК);
- РНК-праймазы (образуют РНК-затравки, праймеры);
- ДНК-лигазы (сшивают фрагменты ДНК).
С помощью геликаз в определенных участках ДНК расплетается, одноцепочечные участки ДНК связываются дестабилизирующими белками, образуется репликационная вилка . При расхождении 10 пар нуклеотидов (один виток спирали) молекула ДНК должна совершить полный оборот вокруг своей оси. Чтобы предотвратить это вращение ДНК-топоизомераза разрезает одну цепь ДНК, что дает ей возможность вращаться вокруг второй цепи.
ДНК-полимераза может присоединять нуклеотид только к 3"-углероду дезоксирибозы предыдущего нуклеотида, поэтому данный фермент способен передвигаться по матричной ДНК только в одном направлении: от 3"-конца к 5"-концу этой матричной ДНК. Так как в материнской ДНК цепи антипараллельны, то на ее разных цепях сборка дочерних полинуклеотидных цепей происходит по-разному и в противоположных направлениях. На цепи 3"-5" синтез дочерней полинуклеотидной цепи идет без перерывов; эта дочерняя цепь будет называться лидирующей . На цепи 5"-3" — прерывисто, фрагментами (фрагменты Оказаки ), которые после завершения репликации ДНК-лигазами сшиваются в одну цепь; эта дочерняя цепь будет называться запаздывающей (отстающей ).
Особенностью ДНК-полимеразы является то, что она может начинать свою работу только с «затравки» (праймера ). Роль «затравок» выполняют короткие последовательности РНК, образуемые при участи фермента РНК-праймазы и спаренные с матричной ДНК. РНК-затравки после окончания сборки полинуклеотидных цепочек удаляются.
Репликация протекает сходно у прокариот и эукариот. Скорость синтеза ДНК у прокариот на порядок выше (1000 нуклеотидов в секунду), чем у эукариот (100 нуклеотидов в секунду). Репликация начинается одновременно в нескольких участках молекулы ДНК. Фрагмент ДНК от одной точки начала репликации до другой образует единицу репликации — репликон .
Репликация происходит перед делением клетки. Благодаря этой способности ДНК осуществляется передача наследственной информации от материнской клетки дочерним.
Репарация («ремонт»)
Репарацией называется процесс устранения повреждений нуклеотидной последовательности ДНК. Осуществляется особыми ферментными системами клетки (ферменты репарации ). В процессе восстановления структуры ДНК можно выделить следующие этапы: 1) ДНК-репарирующие нуклеазы распознают и удаляют поврежденный участок, в результате чего в цепи ДНК образуется брешь; 2) ДНК-полимераза заполняет эту брешь, копируя информацию со второй («хорошей») цепи; 3) ДНК-лигаза «сшивает» нуклеотиды, завершая репарацию.
Наиболее изучены три механизма репарации: 1) фоторепарация, 2) эксцизная, или дорепликативная, репарация, 3) пострепликативная репарация.
Изменения структуры ДНК происходят в клетке постоянно под действием реакционно-способных метаболитов, ультрафиолетового излучения, тяжелых металлов и их солей и др. Поэтому дефекты систем репарации повышают скорость мутационных процессов, являются причиной наследственных заболеваний (пигментная ксеродерма, прогерия и др.).
Строение и функции РНК
— полимер, мономерами которой являются рибонуклеотиды . В отличие от ДНК, РНК образована не двумя, а одной полинуклеотидной цепочкой (исключение — некоторые РНК-содержащие вирусы имеют двухцепочечную РНК). Нуклеотиды РНК способны образовывать водородные связи между собой. Цепи РНК значительно короче цепей ДНК.
Мономер РНК — нуклеотид (рибонуклеотид) — состоит из остатков трех веществ: 1) азотистого основания, 2) пятиуглеродного моносахарида (пентозы) и 3) фосфорной кислоты. Азотистые основания РНК также относятся к классам пиримидинов и пуринов.
Пиримидиновые основания РНК — урацил, цитозин, пуриновые основания — аденин и гуанин. Моносахарид нуклеотида РНК представлен рибозой.
Выделяют три вида РНК : 1) информационная (матричная) РНК — иРНК (мРНК), 2) транспортная РНК — тРНК, 3) рибосомная РНК — рРНК.
Все виды РНК представляют собой неразветвленные полинуклеотиды, имеют специфическую пространственную конформацию и принимают участие в процессах синтеза белка. Информация о строении всех видов РНК хранится в ДНК. Процесс синтеза РНК на матрице ДНК называется транскрипцией.
Транспортные РНК содержат обычно 76 (от 75 до 95) нуклеотидов; молекулярная масса — 25 000-30 000. На долю тРНК приходится около 10% от общего содержания РНК в клетке. Функции тРНК: 1) транспорт аминокислот к месту синтеза белка, к рибосомам, 2) трансляционный посредник. В клетке встречается около 40 видов тРНК, каждый из них имеет характерную только для него последовательность нуклеотидов. Однако у всех тРНК имеется несколько внутримолекулярных комплементарных участков, из-за которых тРНК приобретают конформацию, напоминающую по форме лист клевера. У любой тРНК есть петля для контакта с рибосомой (1), антикодоновая петля (2), петля для контакта с ферментом (3), акцепторный стебель (4), антикодон (5). Аминокислота присоединяется к 3"-концу акцепторного стебля. Антикодон — три нуклеотида, «опознающие» кодон иРНК. Следует подчеркнуть, что конкретная тРНК может транспортировать строго определенную аминокислоту, соответствующую ее антикодону. Специфичность соединения аминокислоты и тРНК достигается благодаря свойствам фермента аминоацил-тРНК-синтетаза.
Рибосомные РНК содержат 3000-5000 нуклеотидов; молекулярная масса — 1 000 000-1 500 000. На долю рРНК приходится 80-85% от общего содержания РНК в клетке. В комплексе с рибосомными белками рРНК образует рибосомы — органоиды, осуществляющие синтез белка. В эукариотических клетках синтез рРНК происходит в ядрышках. Функции рРНК : 1) необходимый структурный компонент рибосом и, таким образом, обеспечение функционирования рибосом; 2) обеспечение взаимодействия рибосомы и тРНК; 3) первоначальное связывание рибосомы и кодона-инициатора иРНК и определение рамки считывания, 4) формирование активного центра рибосомы.
Информационные РНК разнообразны по содержанию нуклеотидов и молекулярной массе (от 50 000 до 4 000 000). На долю иРНК приходится до 5% от общего содержания РНК в клетке. Функции иРНК : 1) перенос генетической информации от ДНК к рибосомам, 2) матрица для синтеза молекулы белка, 3) определение аминокислотной последовательности первичной структуры белковой молекулы.
Строение и функции АТФ
Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) — универсальный источник и основной аккумулятор энергии в живых клетках. АТФ содержится во всех клетках растений и животных. Количество АТФ в среднем составляет 0,04% (от сырой массы клетки), наибольшее количество АТФ (0,2-0,5%) содержится в скелетных мышцах.
АТФ состоит из остатков: 1) азотистого основания (аденина), 2) моносахарида (рибозы), 3) трех фосфорных кислот. Поскольку АТФ содержит не один, а три остатка фосфорной кислоты, она относится к рибонуклеозидтрифосфатам.
Для большинства видов работ, происходящих в клетках, используется энергия гидролиза АТФ. При этом при отщеплении концевого остатка фосфорной кислоты АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфорную кислоту), при отщеплении второго остатка фосфорной кислоты — в АМФ (аденозинмонофосфорную кислоту). Выход свободной энергии при отщеплении как концевого, так и второго остатков фосфорной кислоты составляет по 30,6 кДж. Отщепление третьей фосфатной группы сопровождается выделением только 13,8 кДж. Связи между концевым и вторым, вторым и первым остатками фосфорной кислоты называются макроэргическими (высокоэнергетическими).
Запасы АТФ постоянно пополняются. В клетках всех организмов синтез АТФ происходит в процессе фосфорилирования, т.е. присоединения фосфорной кислоты к АДФ. Фосфорилирование происходит с разной интенсивностью при дыхании (митохондрии), гликолизе (цитоплазма), фотосинтезе (хлоропласты).
АТФ является основным связующим звеном между процессами, сопровождающимися выделением и накоплением энергии, и процессами, протекающими с затратами энергии. Кроме этого, АТФ наряду с другими рибонуклеозидтрифосфатами (ГТФ, ЦТФ, УТФ) является субстратом для синтеза РНК.
Перейти к лекции №3 «Строение и функции белков. Ферменты»
Перейти к лекции №5 «Клеточная теория. Типы клеточной организации»
До сих пор мы говорили об участии отдельных белков в репликации так, как будто бы они работают независимо друг от друга. Между тем в действительности большая часть этих белков объединена в крупный комплекс, который быстро движется вдоль ДНК и согласованно осуществляет процесс репликации с высокой точностью. Этот комплекс сравнивают с крошечной "швейной машиной" : "деталями" его служат отдельные белки, а источником энергии - реакция гидролиза нуклеозидтрифос фатов. Спираль расплетается ДНК-хеликазой; этому процессу помогают ДНК- топоизомераза, раскручивающая цепи ДНК, и множество молекул дестабилизирующего белка, связывающихся с обеими одиночными цепями ДНК. В области вилки действуют две ДНК-полимеразы - на ведущей и отстающей цепи. На ведущей цепи ДНК-полимераза работает непрерывно, а на отстающей фермент время от времени прерывает и вновь возобновляет свою работу, используя короткие РНК-затравки, синтезируемые ДНК-праймазой. Молекула ДНК-праймазы непосредственно связана с ДНК-хеликазой, образуя структуру, называемую праймосомой. Праймосома движется в направлении раскрывания репликационной вилки и по ходу движения синтезирует РНК-затравку для фрагментов Оказаки. В этом же направлении движется ДНК-полимераза ведущей цепи и, хотя на первый взгляд это трудно представить, ДНК-полимераза отстающей цепи. Для этого, как полагают, последня накладывает цепь ДНК, которая служит ей матрицей, саму на себя, что и обеспечивает разворот ДНК-полимеразы отстающей цепи на 180 градусов. Согласованное движение двух ДНК-полимераз обеспечивает координированную репликацию обеих нитей. Таким образом, в репликационной вилке одновременно работают около двадцати разных белков (из которых мы назвали только часть), осуществляя сложный, высокоупорядоченный и энергоемкий процесс.
Согласованность процессов репликации ДНК и клоеточного деления
Эукариотическая клетка перед каждым делением должна синтезировать копии всех своих хромосом. Репликация ДНК эукариотической хромосомы осуществляется посредством разделени хромосомы на множество отдельных репликонов. Такие репликоны активируются не все одновременно, однако клеточному делению должна предшествовать обязательная однократная репликация каждого из них. Из сказанного ясно, что по хромосоме эукариот в каждый момент времени может двигаться независимо друг от друга множество репликационных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейся в противоположном направлении, или по достижении конца хромосомы. В результате вся ДНК хромосо мы в короткий срок оказывается реплицированной. После сборки на молекуле ДНК хромосомных белков каждая пара хромосом в процессе митоза упорядоченно разделяется по дочерним клеткам.
Выводы
Процесс репликации ДНК согласован с клеточным делением и требуетсовместного действия многих белков. В нем участвуют:
1. ДНК-хеликаза и дестабилизирующие белки; они расплетают двойную спираль родительской ДНК и формируют репликационную вилку.
2. ДНК-полимеразы, которые катализируют синтез полинуклеотидной цепи ДНК в направлении 3"-5, копируя в репликационной вилке матрицу с высокой степенью точности. Поскольку две цепи двойной спирали ДНК антипараллельны, в направлении 5"-3" непрерывно синтезируется лишь одна из двух цепей, ведущая; другая цепь, отстающа, синтезируется в виде коротких фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза способна к исправлению собственных ошибок, но не может самостоятельно начать синтез новой цепи.
3. ДНК-праймаза, которая катализирует короткие молекулы РНК-затравки. Впоследствии фрагменты РНК удаляются - их заменяет ДНК.
4.Теломераза, заканчивающая построение недорепликацированых 3"-концов линейных молекул ДНК.
5. ДНК-топоизомеразы, помогающие решить проблемы кручения и спутывания спирали ДНК.
6. Инициаторные белки, связывающиеся в точке начала репликации и способствующие образованию нового репликационного глазка с одной или двумя вилками. В каждой из вилок вслед за инициаторными белками к расплетенной ДНК сначала присоединяется белковый комплекс, состоящий из ДНК-хеликазы и ДНК-праймазы (праймосома).
Затем к праймосоме добавляются другие белки и возникает "репликационная машина", которая и осуществляет синтез ДНК.
Литература
1. О. О. Фаворова. Сохранение ДНК в ряду популяций: репликация ДНК. Соросовский образовательный журнал, 1996 г.
2. Г.М. Дымшиц. Проблема раепликации концов линейных молекул и теломераза. Соросовский образовательный журнал, 2000 г.