Получены при работе с облученными мышами, которым компенсаторно вводили костный мозг от генетически идентичных доноров и опустошенную строму тимуса от генетически идентичных или отличающихся доноров ( рис. 7.11).
Ситуация менялась, если вместо гибридного тимуса трансплантировали тимус родителей Н-2d или Н-2k. В тех случаях, когда Т-прекурсоры костного мозга колонизировали родительский тимус, формировались эффекторы цитотоксической реакции, способные разрушать клетки-мишени только того генотипа, к которому относился тимус ( рис. 7.11).
Ясно, что отсутствие соответствующих рецепторов к собственным молекулам МНС не позволяет тимоцитам пройти полный путь развития и проявить себя в цитолитической реакциии. Через 3-4 дня клетки, неспособные распознать собственные антигены, погибают в тимусе.
События, развивающиеся в тимусе при селекции клеток по их способности распознавать собственные молекулы МНС, представлены на рис. 7.12).
Завершившаяся на первом этапе реорганизация генов для альфа- и бета-цепей обеспечивает экспрессию Т-клеточного рецептора на клеточной поверхности. До окончания положительной селекции уровень экспрессии этих рецепторов незначительный, но вполне достаточный для взаимодействия с соответствующими молекулами. Поскольку реорганизация генов, контролирующих вариабельные области Т-клеточного рецептора (VDJ - для бета-цепи и VJ - для альфа-цепи), процесс случайный, то образуются самые разнообразные по специфичности рецепторы. Условно их можно разбить на три категории:
Рецепторы, которые способны взаимодействовать c молекулами MHC класса I ,
Рецепторы, которые способны взаимодействовать c молекулами MHC класса II , и
Рецепторы, которые такой способностью не обладают.
Кроме того, антигенсвязывающий центр ТКР, независимо от принадлежности к той или иной категории, имеет участок, потенциально способный взаимодействовать с экзогенным чужеродным пептидом.
На стадии умеренной экспресии Т-клеточных рецепторов тимоциты представляют собой сырой материал для отбора. В коре тимуса, обогащенной эпителиальными клетками, которые экспрессируют как молекулы I, так и II классов, происходят основные селекционные процессы. Если тимоциты обладают рецепторами, способными взаимодействовать с молекулами I или II классов, то они подвергаются дальнейшей дифференцировке. Судьба тимоцитов, чьи рецепторы не сответствуют специфичностям молекул МНС, завершается в тимусе.
Селекция тимоцитов по специфичности их рецепторов - процесс крайне жесткий. Более 90% клеток гибнет в органе и только незначительная их часть, прошедшая сито отбора (менее 5%), "обречена" на дальнейшую жизнь.
Если клетка не выдержала первичного положительного отбора, она еще некоторое время (3-4 суток) остается жизнеспособной и продолжает реорганизовывать гены альфа-цепи ТКР, представляя новые по специфичности рецепторы. Иначе, отбор не завершается на исходном сочетании альфа-бета-цепей. Клетка "стремится прийтись ко двору" посредством изменения специфичности рецепторов за счет альфа-цепей. Без этого дополнительного механизма гибель тимоцитов, не прошедших первичного отбора, была бы еще выше.
На этапе формировании клонов, способных взаимодействовать с одной из молекул МНС, процесс дифференцировки клеток не заканчивается. Тимоциты, подвергающиеся отбору, экспрессируют как CD4 , так и CD8 корецепторы. Однако как только отбор на специфичность произошел, тимоциты теряют один из корецепторов.
Во всех случаях отбор на специфичность к молекулам I класса определяет сохранение CD8 и потерю CD4.
Напротив, тимоциты прошедшие селекцию к молекулам II класса, экспрессируют CD4, и подавляют синтез CD8.
Наиболее четко корреляция фенотипических маркеров со специфичностью рецепторов показана на трансгенных мышах.
Если мышам вводили реорганизованные гены для альфа-бета-цепей ТКР со специфичностью к молекулам I класса, то все образовавшиеся зрелые Т-клетки имели фенотип T-киллеров (CD8).
В ситуации, когда специфичность касалась молекул II класса, все зрелые Т-клетки несли корецептор T-хелперов (CD4).
Коррелятивная связь корецепторов со специфичностью Т-рецепторов показана и на других экспериментальных моделях. Мутантные мыши, у которых отсутствуют молекулы II класса, не способны образовывать CD4+-лимфоциты. Введение таким мышам трансгена, кодирующего синтез молекул II класса, полностью восстанавливало формирование CD4+-клеток.
Определяющим моментом экспрессии одного из двух корецепторов в процессе созревания тимоцитов является их способность взаимодействовать с теми молекулами МНС, к которым проходит селекция:
CD4 - c молекулами II класса и
После такого распознавания завершается, наконец, путь внутритимусной дифференцировки тимоцитов с образованием T-хелперов и T-киллеров , мигрирующих на периферию.
В дальнейшем выжившие Т-лимфоциты опускаются в мозговой слой тиму-са, где проходят этап отрицательной (негативной) селекции. При этом они вза-имодействуют с тимическими дендритными клетками , экспрессирующими комплексы молекул гистосовместимости с пептидами, полученными из разно-образных молекул собственного организма. В результате подобного взаимо-действия выживают только те Т-лимфоциты, чей антигенраспознающий ре-цептор не способен распознавать указанные комплексы, а остальные гибнут путем индуцированного апоптоза что достигается за счет продукции глюкокор-тикоидов. За счет механизма отрицательной селекции осуществляется профи-лактика аутоиммунных заболеваний .
В целом выживает лишь около 2-5% всех клеток, прибывших в тимус для дифференцировки, что свидетельствует о чрезвычайно жестком отборе Т-лимфоцитов и высокой степени надежности механизма формирования централь-ной иммунной толерантности . Однако все же в тимусе представлены не все имеющиеся аутоантигены, поэтому необходимо осуществление механизмов поддержания толерантности на периферии.
Основная феноменологияПредставления о том, что тимус является одним из главных органов, определяющих формирование иммунной системы в целом и Т-системы в частности, стали складываться в начале 60-х годов XX в. после опытов Дж. Миллера по неонатальной тимэктомии у мышей. Удаление тимуса у мышей сразу после рождения приводит к: а) резкому истощению популяции лимфоцитов в периферических органах; б) более длительному выживанию аллогенных кожных трансплантатов; в) нарушению образования антител. Кроме того, тимэктомированные животные характеризуются высокой смертностью в первые 4 месяца жизни, повышенной восприимчивостью к инфекциям, большей чувствительностью к действию эндотоксинов, склонностью к развитию опухолей.Иммунологическую реактивность можно восстановить пересадкой тимэктомированным мышам тимуса от молодых животных, а также введением клеток селезенки, лимфатических узлов или большого числа тимоцитов. Клетки костного мозга даже в очень значительных дозах неэффективны. Этот факт сам по себе примечателен, так как демонстрирует, что лимфоцитам костного мозга для выполнения утраченных при тимэктомии иммунологических функций необходим тимус.
Примером роли тимуса в становлении иммунной компетенции является синдром ДиДжоржи.
Синдром характеризуется врожденным недоразвитием тимуса, что приводит к резкому снижению популяции Т-лимфоцитов. Дети с подобным иммунодефицитным заболеванием имеют повышенную чувствительность к вирусным, грибковым и некоторым бактериальным инфекциям.
Критическая роль стромы тимуса продемонстрирована на двух мутантных линиях мышей: nude и scid, характеризующихся отсутствием зрелых Т-клеток. Если дефицит Т-клеток у nude связан с неспособностью эпителиальных клеток рудиментарного тимуса обеспечивать дифференцировку костномозговых предшественников до зрелых форм, то у scid он связан с дефектом процесса рекомбинации рецепторных генов. Трансплантация тимуса от линии scid линии nude полностью восстанавливает дифференцировку костномозговых предшественников до зрелых Т-клеток, так же как введение клеток костного мозга от nude мышам scid приводит к полноценному накоплению Т-клеток. Эта форма трансплантации ясно указывает, во-первых, на потенциальную способность костномозговых предшественников nude дифференцироваться в Т-клетки и, во-вторых, на необходимость эпителиального микроокружения тимуса для реализации такой способности.
Этапы внутритимусной дифференцировки лимфоцитов
Два наблюдения: необходимость тимуса для накопления функционально зрелых Т-клеток на периферии и высокая гибель активнопролиферирующих тимоцитов in situ - указывают на тот факт, что в тимусе происходят те основные события, которые определяют полноценность работы всей Т-системы.
Подобная феноменология требовала выяснения по крайней мере двух вопросов: каков биологический смысл массовой гибели клеток в тимусе и как формируются субпопуляции клоноспецифических Т-клеток (Т-киллеров, Т-хелперов) в органе?
Этапы внутритимусной дифференцировки клеток от мигрировавшего в орган костномозгового предшественника (пре-Т-клетки) до зрелого Т-лимфоцита, покидающего тимус, связаны с изменением экспрессии фенотипических, Т-клеточных маркеров.Основными из них являются: CD4 - корецептор Т-хелперов, CD8 - корецептор цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ; Т-киллеров) и TCR„3 - Т-клеточный антигенраспознающий рецептор. Специфическая комбинация этих поверхностных молекул может быть использована в качестве маркеров дифференцировки клеток в тимусе.
Первые мигранты из костного мозга, пре-Т-клетки, представляют собой лимфобласты, имеющие определенный набор поверхностных молекул, но лишенные основных маркеров дифференцировки - CD4 и CD8. Отсюда их название - «двойные негативы».
Они заселяют верхнюю часть коры тимуса, расположенную непосредственно под капсулой органа - субкапсулярную область. В полностью развитом тимусе двойные негативные клетки составляют незначительный, всего около 5 % от общего числа тимоцитов, клеточный пул.
Взаимодействие раннего предшественника со стромой субкапсулярной области приводит к экспрессии первого специфического маркера Т-клеток Thy-1. Молекула обладает адгезивными свойствами и относится к суперсемейству иммуноглобулинов. Thy-1 является исключительным маркером Т-клеток мышей и сохраняется на всех стадиях дифференцировки данных клеток, хотя уровень его экспрессии у более зрелых тимоцитов и периферических Т-клеток снижен по сравнению с ранними предшественниками. Тимоцитарные бласты субкапсулярной области, находясь в тесном контакте с эпителиальными клетками-кормилицами, активно пролиферируют и завершают свой путь развития в данной области умеренной экспрессией CD4 и CD8. Тимоциты с фенотипом CD4*, CD8*, TCRB*перемещаются в корковый слой.
Клетки коры - это в основном малые, плотно упакованные тимоциты.
Они находятся в непосредственных контактных отношениях с кортикальными эпителиальными клетками, обладаюдвойные позитивные тимоциты становятся обладателями полноценных aBTCR. Таким образом, основной фенотип кортикальных тимоцитов - CD4+, CD8+, TCR+aB. Факт прохождения положительной селекции в коре определяет дальнейшую дифференцировку на субпопуляции CD4+CD8- и CD4-CD8+, которая осуществляется в основном в переходной области - кортикомедуллярном соединении под влиянием взаимодействия с дендритными клетками и макрофагами. Эти клетки получили название «одинарных позитивов». Здесь же проходит и отрицательная селекция тимоцитов (см. ниже). В результате прошедших дифференцировочных событий в медуллярной области накапливаются клетки с фенотипом CD4+CD8-TCR+ (Т-хелперы) и CD4-CD8+TCR+ (Т-киллеры), часть которых мигрирует в периферические лимфоидные органы.
Реорганизация генов Т-клеточного рецептора в процессе дифференцировки тимоцитов
Наиболее ранний предшественник Т-клеток, мигрировавший из костного мозга в субкапсулярную область тимуса, обладает нативной организацией генов для TCR - исходным состоянием генома, которое определяется как генная организация зародышевой линии развития. В результате взаимодействия субкапсулярных тимоцитов с эпителиальными клетками данного региона происходит первое реорганизационное событие. На этом этапе внутритимусного развития оно касается только генов для B-цепи TCR и проявляется в объединении D-сегмента с J-сегментом в одном из двух генных кластеров.По мере дальнейшего развития тимоцитов происходит второе реорганизационное событие - объединение одного из 20 V-генов с DJ, что приводит с синтезу полноценной B-цепи. На этом третьем этапе развития синтезируемая B-цепь еще остается в цитоплазме и фенотип клеток неотличим от фенотипа предыдущего этапа (CD4-, CD8-, TCR-).
Начало умеренной экспрессии B-цепи в комплексе с CD3-пептидами является сигналом для реорганизации генов а-цепи, а также выхода на клеточную поверхность CD4 и CD8. Эти внутриклеточные события сопряжены с переходом тимоцитов из субкапсулярной области во внутренний корковый слой. Фенотип этих клеток - CD4+, CD8+, TCR+-B. Вскоре тимоциты коры начинают умеренную экспрессию функционально полноценного TCRaB. Фенотип таких клеток - CD4+, CD8+, TCR+-aB. После завершения процесса представления основных функционально активных антигенраспознающих рецепторов создаются условия для селекции тимоцитов по их способности распознавать собственные молекулы МНС.
Положительная и отрицательная селекция клеток в тимусе. Формирование клоноспецифических Т-клеток. Эксперименты, демонстрирующие распознавание рецепторами Т-клеток комплекса «своего с чужим»
В начале были представлены молекулярные основы двойного распознавания Т-клетками - распознавания молекул I или II класса МНС и ассоциированных с ними антигенных пептидов. Изучению молекулярных механизмов такого распознавания предшествовали опыты с использованием систем взаимодействия несингенных (аллогенных) клеток in vitro.
Первые опыты в этом направлении были проведены с инбредными морскими свинками линий 2 и 13, которые отличаются друг от друга только по генам, контролирующим антигены II класса МНС. Т-клетки морских свинок, предварительно сенсибилизированных одним из антигенов (овальбумин, туберкулин и др.), вносили в культуру макрофагов, которые презентируют антиген, использованный для иммунизации. Во всех случаях, когда макрофаги и Т-клетки были генетически идентичными (сингенными), регистрировался сильный пролиферативный ответ Т-клеток, распознавших антиген на поверхности сингенных макрофагов. В то же время Т-клетки, отличающиеся от макрофагов по антигенам II класса, не в состоянии развить пролиферативный ответ в несингенной системе клеточного взаимодействия. Эти первые опыты позволили предположить, что примированные Т-клетки распознают не только антиген, использованный для иммунизации, но и собственные антигены гистосовместимости. Однако узнать антиген на чужеродной (аллогенной) макрофагальной поверхности, имеющей отличающуюся молекулу II класса МНС, этим клеткам не удается.
Демонстративные опыты были проведены с клонами Т-клеток от гибридных морских свинок (2х13)F1 иммунизированных двумя антигенами - овальбумином и туберкулином. От примированных животных выделили 4 клона антигенреактивных Т-клеток, каждый из которых способен реагировать только на один из антигенов, ассоциированных с макрофагами одной из родительских линий (линией 2 или линией 13). Результаты реакции оценивали по интенсивности пролиферации клонированных Т- клеток, взаимодействующих in vitro с макрофагами определенной линии, презентирующими один из антигенов: макрофаги линии 2 + овальбумин, макрофаги линии 13 + овальбумин, макрофаги линии 2 +туберкулин и макрофаги линии 13 + туберкулин. Во всех без исключения случаях реакция Т-клеток регистрировалась только на то сочетание макрофага с антигеном, к которому прошло клонирование. Замена либо гаплотипа макрофага, либо антигена отменяла реакцию пролиферации. Поскольку две линии морских свинок отличаются друг от друга только по генам, контролирующим молекулы II класса МНС, был сделан вывод, что отдельный клон Т-клеток имеет антигенраспознающие рецепторы, направленные на комплекс антигена с продуктами этих генов.
Представленные опыты, несмотря на свой феноменологический характер, позволяли сделать принципиальное заключение: рецепторы Т-клеток распознают не собственно чужеродный антиген, а его комплекс с молекулами МНС. Однако они не давали ответа на вопрос: с какой субпопуляцией Т-клеток связано двойное распознавание?Специальные исследования по выяснению данного вопроса констатировали, что рестрикция по генам МНС существует для Т-хелперов и для Т-киллеров. При этом ограничения в зависимости от характера субпопуляции касаются разных генов МНС, как контролирующих молекулы I класса, так и ответственных за синтез молекул II класса.
В опытах in vitro по генерации Т-хелперов, усиливающих продукцию антител, были получены следующие результаты. В культуру поглотивших антиген макрофагов вносились предшественники Т-хелперов, либо генетически идентичные, либо отличающиеся от макрофагов по генам МНС. После определенного времени совместного культивирования Т-клетки переносили во вторичную культуру, содержащую сингенные клетки селезенки (источник антителопродуцентов) и гомологичный антиген. Когда Т-лимфоциты получали от первичной культуры, в которой взаимодействующие клетки были идентичны по генам, контролирующим молекулы II класса, констатировалось сильное развитие иммунного ответа. В то же время Т-клетки от культуры, содержащей не идентичные по генам II класса клетки, оказались неспособными обеспечить хелперный эффект во вторичной культуре.
Таким образом, созревание Т-хелперов из предшественников в первичной культуре происходит только в условиях идентичности между взаимодействующими клетками по молекулам II класса. Различия, затрагивающие поверхностные молекулы, контролируемые другими генами МНС, не имели значения для генерации Т-хелперов. Сходные по целевой направленности опыты были проведены при использовании двух систем анализа - in vivo и in vitro. Мышей определенного гаплотипа иммунизировали не нативным антигеном, как это делается в обычной экспериментальной работе, а антигеном, прошедшим переработку в макрофаге и представленным на его поверхности в иммуногенной форме. Схема опыта включала два этапа. Первый этап - иммунизация in vivo. Мышам определенного гаплотипа вводили несингенные, отличающиеся по генам II класса макрофаги, которые экспрессировали чужеродный антиген. После определенного времени от иммунизированных животных выделяли сенсибилизированные клетки селезенки. Второй этап экспериментов состоял в изучении способности выделенных клеток развивать вторичный ответ in vitro при взаимодействии с макрофагами различных гаплотипов. Выяснилось, что вторичный ответ развивается только в том случае, если в систему вносят макрофаги, генетически идентичные тем, которые были использованы при первичной иммунизации in vivo. Макрофаги, сингенные клеткам селезенки, не могли индуцировать вторичный ответ.
Объяснение этому эксперименту, как и предыдущему, сводится к следующему. В процессе первичной иммунизации Т-хелперы распознают чужеродный антиген в комплексе с молекулами II класса. В результате накапливается клон Т-хелперов, обладающих антигенраспознающими рецепторами, специфичность которых ограничена особенностями строения как чужеродного антигена, так и молекул II класса МНС. Во вторичной культуре такой клон отвечает только на комплекс, использованный при иммунизации.
Цитотоксические Т-клетки, как и Т-хелперы, распознают не собственно чужеродный антиген, а его комплекс с молекулами МНС, однако ограничения в данном случае касаются молекулI класса. Это заключение было сделано по результатам достаточно, простых, но демонстративных опытов. Мышей с определенным гаплотипом иммунизировали одним из вирусов. От примированных животных получали Т-клетки, которые использовали в цитотоксическом тесте с клетками-мишенями. В тех случаях, когда Т-киллеры и мишени обладали идентичным геном, контролирующим молекулы I класса (Н-2К или H-2D), развивалась сильная цитотоксическая реакция. При генетических различиях по генам I класса реакция не развивалась. Ограничения касались толь- i ко этих генов и не затрагивали генов, контролирующих антигены II класса. Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве антигена гаптена.
Объяснение полученных данных строится на том представлении, что в процессе примирования происходит селекция клона Т-киллеров, способных распознавать комплекс антигена с молекулами I класса определенного гаплотипа. В связи с этим популяция Т-клеток, обогащенная специфическими Т-киллерами, будет распознавать только те зараженные вирусом мишени, которые имеют тот же генотип по генам I класса, что и стимулирующие клетки.
Положительная селекция клеток в тимусе
Прямые доказательства роли стромы тимуса в селекции тимоцитов, распознающих собственные молекулы МНС, получены при работе с облученными мышами, которым компенсаторно вводили костный мозг от генетически идентичных доноров и опустошенную строму тимуса от генетически идентичных или отличающихся доноров.
Гибридных мышей (H-2dxH-2k)F| облучали летальной дозой, чтобы выбить собственные лимфоидные клетки, и тимэктомировали. В контрольных опытах обработанным подобным образом животным трансплантировали костный мозг и строму тимуса от гибридных же (сингенных) доноров. Через 3 месяца (время, достаточное для полного восстановления утраченной при облучении лимфоидной ткани) животных заражали вирусом оспы и еще через 6 дней, по завершении латентного периода, из селезенки иммунизированных животных выделяли лимфоциты. Цитотоксиче скую активность этих клеток проверяли на клетках-мишенях одного из родителей (гаплотип родителей Н-2к или H-2d). В обоих случаях эффекторные Т-клетки гибридов развивали цитотоксическую реакцию.
Забегая вперед, следует заметить, что эти результаты легко объясняются внутритимусной селекцией к «своему». Если распознавание «своего» действительно происходит в тимусе, то предшественники гибридного, трансплантированного костного мозга, оказавшись в гибридном тимусе, встречают как молекулы Н-2к, так и молекулы H-2d, экспрессирующиеся на эпителиальных, стромальных клетках органа. Приобретя специфический рецептор к молекулам того или иного генотипа, клетки проходят селекцию на образование клонов, способных реагировать с комплексом молекула МНС+экзогенный антиген (пептид). В результате такие отобранные лимфоциты разрушают мишени как Н-2К так и H-2d.
Ситуация меняется, если вместо гибридного тимуса трансплантируется тимус родителей H-2d или Н-2к. Когда Т-прекурсоры костного мозга колонизируют родительский тимус, формируются эффекторы цитотоксической реакции, способные разрушать клетки-мишени только того генотипа, к которому относился тимус. Гибридные пре-Т-клетки костного мозга, заселяющие родительский тимус, строма которого экспрессирует только одну аллельную форму молекул МНС (H-2d или Н-2к), после достижения стадии развития с фенотипом CD4+CD8+aВTCR± имеют множество клонов с разной специфичностью по aВTCR. Однако дальнейший путь развития обеспечен только тем клонам, которые распознали молекулы МНС, характерные для тимуса данного генотипа. Все остальные погибают и не выходят на периферию.
Более прямые доказательства были получены при использовании трансгенных мышей. Когда реорганизованные гены для Т-клеточного рецептора вводятся в геном мышей, перестройка эндогенных генов подавляется, так что большинство развивающихся Т-клеток экспрессируют рецептор, который кодируется трансгенами для а- и В-цепей. При введении трансгенов мышам известного генотипа по МНС можно установить влияние молекул этого комплекса на созревание тимоцитов. Например, введение трансгенов аВ-цепей, специфичных к молекулам I класса генотипа Н-2а, мышам с генотипом Н-2Ь приводит к незавершенной дифферен-цировке тимоцитов Н-2Ь, заканчивающейся на стадии CD4+CD8+. Если таких трансгенных мышей заразить вирусом, их Т-клетки будут разрушать вирусинфицированные мишени, относящиеся к генотипу Н-2а, но не Н-2Ь, как это происходит с Т-клетками нормальных мышей.
Ясно, что отсутствие соответствующих рецепторов к собственным молекулам МНС не позволяет тимоцитам пройти полный путь развития и проявить себя в цитолитической реакции. Через 3-4 дня клетки, не способные распознать собственные антигены, погибают в тимусе. События, развивающиеся в тимусе при селекции клеток по их способности распознавать собственные молекулы МНС. Завершившаяся на первом этапе реорганизация генов для а- и В-цепей обеспечивает экспрессию Т-клеточного рецептора на клеточной поверхности. До окончания положительной селекции уровень экспрессии этих рецепторов незначительный, но вполне достаточный для взаимодействия с соответствующими молекулами. Поскольку реорганизация генов, контролирующих вариабельные области Т-клеточного рецептора (VDJ - для В-цепи и VJ - для а-цепи), - процесс случайный, то образуются самые разнообразные по специфичности рецепторы. Условно их можно разбить на две категории: те, которые способны взаимодействовать с молекулами I или II класса, и те, которые такой способностью не обладают. Кроме того, антигенсвязующий центр рецепторов независимо от принадлежности к той или иной категории имеет участок, потенциально способный взаимодействовать с экзогенным, чужеродным пептидом.
На стадии умеренной экспрессии Т-клеточных рецепторов тимоциты представляют собой сырой материал для отбора. В коре тимуса, обогащенной эпителиальными клетками, которые экспрессируют молекулы как I, так и II классов, происходят основные селекционные процессы. Если тимоциты обладают рецепторами, способными взаимодействовать с молекулами I или II класса, то они подвергаются дальнейшей дифференцировке. Судьба тимоцитов, чьи рецепторы не соответствуют специфичностям молекул МНС, завершается в тимусе. Селекция тимоцитов по специфичности их рецепторов - процесс крайне жесткий. Более 90 % клеток гибнет в органе и только незначительная их часть, прошедшая сито отбора (менее 5 %), «обречена» на дальнейшую жизнь. Если клетка «не выдержала» первичного положительного отбора, она еще некоторое время (3 - 4 суток) остается жизнеспособной и продолжает реорганизовывать гены а-цепи, представляя новые по специфичности рецепторы. Иначе, отбор не завершается на исходном сочетании ар-цепей. Клетка «стремится прийтись ко двору» посредством изменения специфичности рецепторов за счет а-цепей. Без этого дополнительного механизма гибель тимоцитов, не прошедших первичного отбора, была бы еще выше.
На этапе формирования клонов, способных взаимодействовать с одной из молекул МНС, процесс дифференцировки клеток не заканчивается. Тимоциты, подвергающиеся отбору, экспрессируют как CD4-, так и С08-корецепторы. Однако как только отбор на специфичность произошел, тимоцит теряет один из корецепторов. Во всех случаях отбор на специфичность к молекулам I класса определяет сохранение CD8 и потерю CD4. Напротив, тимоциты, прошедшие селекцию к молекулам II класса, экспрессируют CD4 и подавляют синтез CD8.
Наиболее четко корреляция фенотипических маркеров со специфичностью рецепторов показана на трансгенных мышах. Если мышам вводили реорганизованные гены для аВ-цепей со специфичностью к молекулам I класса, то все образовавшиеся зрелыеТ-клетки имели фенотип Т-киллеров (CD8). В ситуации, когда специфичность касалась молекул II класса, все зрелые Т-клетки несли корецептор Т-хелперов (CD4). Коррелятивная связь корецепторов со специфичностью Т-рецепторов показана и на других экспериментальных моделях. Мутантные мыши, у которых отсутствуют молекулы II класса, не способны образовывать СD4+-лимфоциты. Введение таким мышам трансгена, кодирующего синтез молекул II класса, полностью восстанавливало формирование СD4+-клеток.
Определяющим моментом экспрессии одного из двух корецепторов в процессе созревания тимоцитов является их способность взаимодействовать с теми молекулами МНС, к которым проходит селекция: CD4 - с молекулами II класса и CD8 - с молекулами I класса. После такого распознавания завершается, наконец, путь внутритимусной дифференцировки тимоцитов с образованием Т-хелперов и Т-киллеров.
Отрицательная селекция клеток в тимусе
В условиях нормы иммунная система толерантна (терпима) к аутологичным (собственным) антигенам организма. Запрет на иммунную реакцию ко многим аутоантигенам формируется в тимусе. Принципиальная возможность подобного запрета следует из опытов с трансгенными мышами. Специфический рецептор, синтезируемый трансгенами, будет представлен на всех Т-клетках. Если мышам, имеющим наведенный Т-клеточный рецептор, специфичный к комплексу собственной молекулы МНС с чужеродным пептидом, ввести данный пептид, то реакция клеток в тимусе и на периферии будет прямо противоположной: гибель тимоцитов, несущих рецептор заданной специфичности, и стимуляция пролиферации периферических Т-клеток, обладающих тем же рецептором.
Другой экспериментальный пример отрицательной селекции в тимусе связан с половым антигеном, который имеется у мышей-самцов и отсутствует у самок. Трансгенные мыши-самцы, обладающие рецептором, специфичным к комплексу полового антигена с собственными молекулами МНС, характеризуются незавершенным развитием клеток в тимусе. У них дифференцировка тимоцитов, экспрессирующих данный рецептор, заканчивается на стадии двойных позитивов (CD4+CD8+). В популяции одинарных позитивов (CD4+CD8- или СВ4-СВ8+) на периферии также отсутствуют Т-клетки, имеющие рассматриваемый рецептор. В то же время у трансгенных самок тимоциты с рецепторами к антигену самца проходят полный путь дифференцировки и мигрируют на периферию.Возможные механизмы положительной и отрицательной селекции клеток в тимусе
В основе процесса внутритимусной селекции клеток лежит разная степень сродства (аффинности) их рецепторов - молекулам I или II класса МНС. Экспрессия aB-цепей в начальный период развития тимоцитов определяет накопление самых разнообразных по специфичности клеточных клонов, которые вступают в процесс распознавания молекул МНС на эпителиальных клетках коркового слоя. Относительно невысокая степень сродства между рецепторами и молекулами МНС является сигналом к началу дифференцировки тимоцитов и миграции созревших клеток на периферию. Значительная степень сродства между взаимодействующими молекулами будет причиной гибели высокоаффинных клонов в результате апоптоза. Следует заметить, что элиминирующее действие высокой аффинности характерно только для тимуса, но не для периферических лимфоидных образований. Среди клонов клеток тимуса будут и такие, рецепторы которых либо вообще не взаимодействуют с молекулами МНС, либо это взаимодействие осуществляется при крайне низкой степени аффинности. В обоих случаях судьба низкоаффинных клонов предопределена: они гибнут в области кортико-медуллярного соединения. И наконец, одно из явлений внутритимусного развитияклеток связано с элиминацией аутореактивных (запрещенных) клонов. Успешное распознавание молекул МНС в корковом слое еще не является гарантией завершения процесса развития клона и его миграции на периферию. Если рецепторы тимоцитов способны распознавать собственные антигены (аутоантигены) в комплексе с молекулами МНС, то клетки с подобными рецепторами элиминируются и их путь развития заканчивается на ранних стадиях развития. Фенотип клеток, не прошедших отбор на специфичность, соответствует двойным позитивам (CD4+CD8+) и указывает на незавершенность дифференцировки.
Итак, клетки, погибающие в тимусе, не выдерживают два условия отбора: первое - наличие некоторой средней степени сродства между рецепторами и молекулами МНС (очень высокая и очень низкая аффинность рецепторов приводит к гибели тимоцитов); второе - отсутствие реакции на собственные антигены (аутоантигены). Меньшая часть популяции тимоцитов, прошедших жесткие условия отбора на специфичность, покидает орган после завершения внутритимусного этапа дифференцировки.
Предшественники, прекоммитированные к развитию в
, непрерывно мигрируют от костного мозга в вилочковую железу, однако их число, по-видимому, очень мало. Незрелые предшественники Т-клеток поступают в область коры вилочковой железы, где созревают в функциональные субпопуляции Т-клеток. Особенностью развития тимоцитов является высокая скорость пролиферации.
У человека возможно и экстратимическое созревание Т-клеток
, однако для оптимального развития Т-лимфоцитов необходимо наличие неповрежденной вилочковой железы.
Различные стадии развития тимоцита можно определить по изменению экспрессии поверхностных и цитоплазматических молекул, рецепторов цитокинов и состояния реаранжировки генов Т-клеточного рецептора. Т-клеточный рецептор (TCR) распознает только короткие пептиды, которые заполняют полость в молекулах первого или второго класса главного комплекса гистосовместимости (МНС I и II, МНС комплекс у человека обозначается как HLA). Презентация таких пептидов Т-лимфоцитам обеспечивается антигенпредставляющими клетками.
TCR - гетеродимерный комплекс, сформированный при ассоциации а-и бета- или у- и S-субъединиц. Каждая из этих субъединиц кодируется отдельным геном. Т-клетки с рецепторами типов ар и уq являются различными линиями, которые разделяются до начала реаранжировки гена TCR.
Наименее зрелые клетки-предшественники в вилочковой железе экспрессируют антиген CD7. Некоторые из них экспрессируют также CD44. CD44, рецептор для гиалуроновой кислоты, - один из факторов, определяющих перемещение предшественников Т-клеток в вилочковую железу. Из этих предшественников далее образуются CD2+/CD7+ клетки, в цитоплазме которых присутствует CD3. Белковый комплекс CD3 обеспечивает передачу сигналов через TCR.
Пептидные цепи CD3-комплекса начинают синтезироваться на стадии про-Т-лимфоцита, и их экспрессия предшествует появлению на мембране TCR.
Т-лимфоциты уq-линии первыми начинают экспрессировать рецептор CD3, но на них нет молекул CD4 или CD8. Несколько позднее на поверхности клеток, экспрессирующих рецептор типа аb, начинают одновременно экспрессироваться антигены CD4 и CD8. К этому времени заканчивается реаранжировка генов а- и р-цепей, и на поверхности клеток экспрессируется рецепторный комплекс TCR ab/CD3.
По мере того как клетки , экспрессирующие CD4+, CD8+ и TCR (так называемые дважды положительные клетки), проходят от коры к мозговому веществу вилочковой железы, они созревают в CD4+ хелперные или CD8+ цитотоксические Т-клетки. Клетки, которые созревают до стадии CD4+ или CD8+, составляют менее 5% тимоцитов. Эти лимфоциты покидают вилочковую железу и заполняют вторичные лимфоидные ткани (лимфатические узлы, селезенку, лимфоидную ткань, ассоциированную со слизистыми оболочками).
Т-лимфоциты с рецептором уq и CD5+B1-клетки являются функционально аналогичными популяциями, которые развиваются параллельно. Т-клетки с рецептором типа уq найдены в различных тканях, включая селезенку, эпидермис и эпителий слизистой оболочки матки, влагалища и языка. Предполагается, что эта популяция клеток может исполнять роль иммунного надзора в перечисленных тканях.
Формирование комплекса Т-клеточного рецептора и положительная и отрицательная селекция в вилочковой железе
Как и гены иммуноглобулинов, гены Т-клеточного рецептора собираются из различных сегментов, находящихся первоначально в зародышевой конфигурации. Гены Т-клеточного рецептора подвергаются процессу соматической реаранжировки, при которой кодирующие сегменты присоединяются друг к другу, а присутствующие между ними интронные последовательности удаляются. Вариабельность соединений и вставок обеспечивает возникновение различий TCR и приводит к огромному количеству различных последовательностей гипервариабельного участка TCR. Репертуар различных TCR считается даже большим, чем репертуар молекул Ig (по оценкам, репертуар ab-TCR составляет 1015, а для yq-TCR - 1018). В отличие от В-лимфоцитов, Т-лимфоциты не секретируют свои рецепторы.
Дважды позитивный тимоцит проходит через многоступенчатый процесс, известный как тимическая селекция. На первой фазе, называемой положительной селекцией, TCR дважды позитивного тимоцита взаимодействуют с молекулами МНС, которые экспрессируются эпителиальными клетками в коре вилочковой железы. Тимоциты, способные распознавать комплекс антигена с молекулой HLA, ускользают от апоптоза и вступают в дальнейшую дифференцировку, в то время как тимоциты, не способные к такому взаимодействию, погибают.
Поскольку рекомбинации , затрагивающие возникновение TCR, являются случайными, в вилочковой железе могут развиваться и пройти позитивную селекцию Т-клетки, экспрессирующие TCR, специфичные к чужеродным и собственным антигенам. Существует вероятность, что Т-клетки, реактивные к собственным структурам организма, будут взаимодействовать с аутоантигенами в тканях, что может привести к нежелательным аутоиммунным реакциям. Для предотвращения этого дважды положительные клетки подвергаются второй фазе отбора, которая называется негативной селекцией. В ходе этой фазы дважды положительные клетки взаимодействуют с комплексом МНС-пептид, экспрессированным на поверхности дендритной клетки.
Т-клетки , TCR которых взаимодействует с комплексом МНС-пептид с высокой аффинностью, подвергаются апоптозу. В ходе негативной селекции удаляются Т-клетки, экспрессирующие TCR, обладающие реактивностью к собственным антигенам.
Дважды положительные клетки , пережившие негативную селекцию, снижают экспрессию корецепторов CD4 или CD8, что приводит к развитию или CD4+CD8" или CD4"CD8+ (моноположительных) Т-лимфоцитов. При этом Т-лимфоциты, распознающие антигены, представляемые молекулами МНС II класса, сохраняют экспрессию корецептора CD4+, a Т-лимфоциты, распознающие антигены, представляемые молекулами МНС I класса, сохраняют экспрессию корецептора CD8+. Эти клетки покидают вилочковую железу и образуют периферические зрелые CD4+ и CD8+ Т-клетки.
Экспрессия некоторых поверхностных молекул при развитии Т-клеток
Клетки и цитокины, регулирующие развитие Т-клеток
Вилочковая железа состоит из корковой и медуллярной областей, различающихся по количеству тимоцитов и составу стромальных клеток. Стромальные клетки вилочковой железы влияют на развитие тимоцитов как посредством прямых межклеточных взаимодействий, так и секрецией растворимых медиаторов.
Тимоциты и клетки тимического эпителия экспрессируют ряд поверхностных клеточных детерминант, некоторые из которых вовлечены в адгезию этих клеточных популяций друг к другу. Рецептор CD2 на тимоцитах определяет связывание с детерминантой CD58 (LFA-3) и межклеточной адгезионной молекулой-1 (ICAM-1), представленными на клетках тимического эпителия. Взаимодействия между развивающимися лимфоцитами и стромой могут активировать обе популяции. Например, связывание тимоцитов со стромой может стимулировать продукцию ИЛ-1 стромальными клетками и повышать экспрессию рецептора ИЛ-2 на тимоцитах.
ИЛ-7 стимулирует полиферацию тимоцитов, и фактор стволовых клеток увеличивает этот эффект. Эпителиальные клетки вилочковой железы у человека являются источником цитокинов ИЛ- 1а и b, ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-8, колониестимулирующих факторов (Г-КСФ и ГМ-КСФ), лейкозингибирующего фактора (LIF) и TGF-p, а также гормонов тимозина или тимопоэтина, оказывающих влияние на пролиферацию и дифференцировку тимоцитов.
Цитокины , необходимые для развития Т-клеток, могут продуцироваться самими Т-клетками. Тимоциты производят IFN-y, ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-3 и ИЛ-4.
Центральными органами иммунной системы являются костный мозг и вилочковая железа (тимус). Это органы воспроизведения и селекции клеток иммунной системы. Здесь происходит лимфопоэз - рождение, размножение (пролиферация) и дифференцировка лимфоцитов до стадии предшественников или зрелых неиммунных (наивных) клеток, а также их
«обучение». Внутри тела человека эти органы имеют как бы центральное расположение.
У птиц к центральным органам иммунной системы относят сумку Фабрициуса (bursa Fabricii), локализованную в области клоаки. В этом органе происходит созревание и размножение популяции лимфоцитов - продуцентов антител, вследствие чего они получили название В-лимфоциты У млекопитающих этого анатомического образования нет, и его функции в полной мере выполняет костный мозг. Однако традиционное название «В-лимфоциты» сохранилось.
Костный мозг локализуется в губчатом веществе костей (эпифизы трубчатых костей, грудина, ребра и др.). В костном мозге находятся полипотентные стволовые клетки, которые являются родоначальницами всех форменных элементов крови и, соответственно, иммунокомпетентных клеток. В строме костного мозга происходит дифференцировка и размножение популяции В-лимфоцитов, которые затем разносятся по всему организму кровотоком. Здесь же образуются предшественники лимфоцитов , которые впоследствии мигрируют в тимус, - это популяция Т-лимфоцитов. Фагоциты и некоторые дендритные клетки также образуются в костном мозге. В нем можно обнаружить и плазматические клетки . Они образуются на периферии в результате терминальной дифференцировки В-лимфоцитов, а затем мигрируют назад, в костный мозг.
Вилочковая железа, или тимус , или зобная железа, располагается в верхней части загрудинного пространства. Этот орган отличает особая динамика морфогенеза. Тимус появляется в период внутриутробного развития. К моменту рождения человека его масса составляет 10-15 г, окончательно он созревает к пятилетнему возрасту, а максимального размера достигает к 10-12 годам жизни (масса 30-40 г). После периода полового созревания начинается инволюция органа - происходит замещение лимфоидной ткани жировой и соединительной.
Тимус имеет дольчатое строение. В его структуре различают мозговой и корковый слои.
В строме коркового слоя
находится большое количество эпителиальных клеток коры, названных «клетки-няньки», которые своими отростками образуют мелкоячеистую сеть, где располагаются «созревающие» лимфоциты. В пограничном, корково-мозговом слое располагаются дендритные клетки тимуса,
а в мозговом - эпителиальные клетки Предшественники Т-лимфоцитов, которые образовались из стволовой клетки в костноммозге, поступают в корковый слой тимуса.
Здесь под влиянием тимических факторов они активно размножаются и дифференцируются (превращаются) в зрелые Т-лимфоциты, а
также «учатся» распознавать чужеродные антигенные детерминанты.
Процесс «обучения» состоит из двух этапов, разделенных по месту и времени, и ивиочает «положительную» и «отрицательную » селекцию.
Положительная селекция . Суть ее заключается в «поддержке» клонов Т-лимфоцитов, рецепторы которых эффективно связались с экспрессированными на эпителиальных клетках собственными молекулами МНС, независимо от структуры инкорпорированных собственных олигопептидов. Активировавшиеся в результате контакта клетки получают от эпителиоцитов коры сигнал на выживание и размножение (ростовые факторы тимуса), а нежизнеспособные или ареактивные клетки погибают.
«Отрицательную» селекцию осуществляют дендритные клетки в пограничной, корково-мозговой зоне тимуса. Ее основная цель - «выбраковка» аутореактивных клонов Т-лимфоцитов. Клетки, позитивно реагирующие на комплекс МНС-аутологичный пептид, подвергаются уничтожению путем индукции у них апоптоза.
Итоги селекционной работы в тимусе весьма драматичны: более 99 % Т-лимфоцитов не выдерживают испытаний и погибают. Лишь менее 1 % клеток превращается в зрелые не-иммунные формы, способные распознать в комплексе с аутологичными МНС только чужеродные биополимеры. Ежесуточно около 10 6 зрелых «обученных» Т-лимфоцитов покидают тимус с крово- и лимфотоком и мигрируют в различные органы и ткани.
Созревание и «обучение» Т-лимфоцитов в тимусе имеют важное значение для формирования иммунитета. Отмечено, что эссенциальное отсутствие или недоразвитие тимуса ведет к резкому снижению эффективности иммунной защиты макроорганизма. Такое явление наблюдается при врожденном дефекте развития вилочковой железы - аплазии или гипоплазии